Perméabilité membranaire et hémolyse PDF

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Cours Perméabilité membranaire et hémolyse, cours et notes et schémas...

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Perméabilité membranaire et hémolyse [email protected]

1- Objectifs a- Définir grâce à l’expérimentation le sens des termes hyper-, iso-, hypo-osmotique et hyper-, iso-, hypo-tonique b- Démontrer l’influence de l’activité de la Na+-K+ ATPase sur la capacité des globules rouges (GR) à résister à des chocs osmotiques

2- Rappels et définitions Les hématies de mammifères sont des cellules simplifiées (ni noyau ni mitochondrie) naturellement isolées et facilement prélevables. Leur substrat énergétique est le glucose. Le plasma (qui correspond pour les hématies au liquide extracellulaire (LEC)) ainsi que le liquide intracellulaire (LIC), ont des concentrations osmolaires proches de 300mOsM bien que leur composition respective soit très différente. La perméabilité de la membrane plasmique aux substances dissoutes est, pour la plupart d’entre elles, beaucoup plus faible que pour l’eau. La membrane plasmique peut donc souvent et à une échelle de temps courte, être considérée comme une membrane semiperméable ne laissant passer que les molécules d’eau. Osmole : C’est une particule libre se déplaçant en solution. Il ne faut pas confondre osmole et mole. Les osmoles tiennent compte de la dissociation des moles dans l’eau (1). Nombre d’osmoles = nombres de moles x coefficient de dissociation (1) -à une mole de saccharose correspond 1 osmole (coeff =1) -à une mole de CaCl2 (1Ca2+ + 2Cl-) correspondent 3 osmoles (coeff = 3) Osmolarité : C’est le nombre d’osmoles exprimé par litre de solution Pression osmotique : Le déplacement aléatoire des osmoles provoquent le choc de celles-ci contre la membrane des GR (dans notre situation) et permettent l’expression d’une force de pression régie (en première approximation) par la loi des gaz parfaits de Van t’Hoff (2). p = n x V-1 x R x T (2) p = pression osmotique en pascal (Pa) / n x V-1 = osmolarité en osml.m-3 R = 8.3J.°K-1.osmol-1 / T = température en degré Kelvin (°K) Hyper-, iso- et hypo-osmotique : Ces termes désignent une solution qui a une osmolarité plus forte, égale ou plus faible que celle d’une solution de référence. Flux : C’est le débit de passage de particules (eau, urée, Na+, Cl-…) par unité de surface de membrane séparant deux compartiments. Il est exprimé par la relation (3). J = M x S-1 = D/e x (C2-C1) (3) J = flux en mol.m-2.s-1 / M = débit en mol.s-1 / S = surface d’échange en m2 / D = coefficient de diffusion e = épaisseur de la membrane / C1 ou 2 = concentration en mol.L-1 des compartiments 1 ou 2 Le flux net correspond à la somme vectorielle entre le flux entrant et le flux sortant.

Hyper-tonique : Le LEC est hyper-tonique lorsque le flux net d’eau est sortant et provoque une contraction des GR. Iso-tonique : Le LEC est iso-tonique au LIC lorsque le flux entrant d’eau est é gal au flux sortant. Le flux net d’eau est alors nul et les GR conservent leur volume normal. Hypo-tonique : Le LEC est hypotonique lorsque le flux net d’eau est entrant et provoque un gonflement puis un éclatement de GR si la résistance de la membrane plasmique est dépassée. Pour des GR en bon état cette valeur se situe autour de 120 – 140mOsM.

3- Manipulation a- Première partie

But : Etude du comportement osmotique du GR en présence de molécules pour lesquelles la perméabilité de la membrane plasmique est différente. 

Préparer une série de 9 tubes contenant chacun 3 mL des solutions définies dans le tableau ci-dessous Hypo-osmotique (mM)

Saccharose 600 mM NaCl 300 mM Urée 600 mM

Iso-osmotique (mM)

140 70 140

Hyper-osmotique (mM)

300 150 300

600 300 600



Rajouter dans chaque tube : 50μL de sang préalablement homogénéisé



Boucher et mélanger en retournant le tube doucement



Centrifuger les tubes pendant 3min à 1400t.min-1 Pensez à préparer un 10ème tube de 3 mL d’eau pour équilibrer la centri



Analyser les niveaux d’hémolyse de chaque tube en remplissant le tableau suivant : Pas d’hémolyse (H-), hémolyse partielle (H+) et hémolyse totale (H++)

Saccharose NaCl Urée

140 mM

300 mM

600 mM

70 mM

150 mM

300 mM

140 mM

300 mM

600 mM

b- Seconde partie

But : Etude de l’influence du fonctionnement de la Na+-K+ ATPase sur la fragilité osmotique du GR Composition du tampon Hépès : Hépès 10 mM, glucose 13 mM, CaCl2 3.38 mM

Utilisation de l’ouabaïne (toxine extraite d’une plante) à 0.1mM pour inhiber environ 50% de la pompe Na+-K+ ATPase. 

Réaliser simultanément deux séries de 8 tubes (300 à 50 mOsM) : une série avec le sang (T) témoin et l’autre série avec le sang expérimental contenant l’ouabaïne (O)

Tube

T8 O8

T7 O7

T6 O6

T5 O5

T4 O4

T3 O3

T2 O2

T1 O1

Concentration (mOsM)

300

180

160

150

140

120

100

50

NaCl 0.573 M (µL)

600

330

280

260

240

190

145

30

0

270

320

340

360

410

455

570

2 000

2 000

2 000

2 000

2 000

2 000

2 000

2 000

50

50

50

50

50

50

50

50

H2O (µL) Tampon Hépès (µL) Sang T / O (µL) 

Boucher et mélanger en retournant doucement le tube



Mettre les deux séries de tubes au bain-marie à 37°C pendant au minimum 30 minutes Remplir deux béchers à moitié d’eau et mettre les tubes dedans



Centrifuger les tubes pendant 3 minutes à 1400 t.min-1



Diluer 11 fois le surnageant (dans les cuves spectro)



Lire au spectrophotomètre à 412 nm contre l’eau distillée (= blanc) Penser à préparer une cuve avec seulement l’eau distillée



Exprimer le pourcentage d’hémolyse pour chaque point : la valeur 100 % correspondant à la lecture faite à 50 mOsM et la valeur 0% correspond à celle pour 300 mOsM.



Tracer et interpréter les deux courbes sur un même graphe : Pourcentage d’hémolyse = f(osmol.L-1). Le point 50% doit être observé pour 140 mOsM avec les hématies témoins. Trouver trois autres techniques pour inhiber la pompe Na/K ATPase.

 Tube Osmolarité DO témoin

8 300

7 180

6 160

5 150

4 140

3 120

2 100

1 50

DO corrigée % Hémolyse témoin

100

DO ouabaïne DO corrigée % Hémolyse ouabaïne

100...