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1. ORIGEN Y DIVERSIFICACIÓN DE LAS ACUAPORINAS Las acuaporinas son proteínas que forman canales de las membranas intracelulares y plasmáticas, transportan principalmente agua por lo que desempeñan un papel crucial en las relaciones hídricas. Tras realizarse muchos estudios, se han identificado acuaporinas en todos los grupos incluyendo arqueas, bacterias, protozoos, levaduras, plantas y animales. Estas proteínas presentan homología de secuencia y comparten similitudes estructurales y funcionales lo que sugiere un papel fundamental en las funciones vitales basales. Actualmente las acuaporinas se relacionan en un sentido amplio con la antigua superfamilia de las MIP (Major Intrinsic Proteins) que muestran una secuencia típica, con seis dominios putativos que atraviesan la membrana y dos motivos Asn-Pro-Ala (NPA) altamente conservados. Mientras que los mamíferos tienen 15 tipos de AQP (descritos hasta ahora) (que muestran 18 parálogos), una sola especie de planta puede presentar más de 120 isoformas (pueden estar presentes en toda la planta o pueden estar asociadas a diferentes tejidos). Esto proporciona capacidad para el transporte de diferentes tipos de solutos fisiológicamente importantes además de agua, como pueden ser CO2, metaloides (boro, silicio), ROS (especies reactivas de oxígeno), H2O2… (Fig 1).

Fig 1. Algunas moléculas transportadas por las acuaporinas Bezerra-Neto João P et al. “Plant Aquaporins: Diversity, Evolution and Biotechnological Applications”.

Por lo tanto, las acuaporinas están involucradas en muchas funciones importantes de las plantas, incluida la captación y transporte de agua (en las raíces y tejidos internos), adquisición de nutrientes, fijación de carbono, movimiento (estomático, de las hojas, de los pétalos), crecimiento, señalización celular, osmorregulación, respuestas al en estrés abiótico (sequía, salinidad, tolerancia a suelos con metales pesados) y biótico (infección por microorganismos), reproducción, germinación. (Fig 2). Según la isoforma se pueden localizar; distribuidas por toda la planta o específicamente en las membranas (membrana plasmática, retículo endoplasmático, vacuolas), y en algunas especies en los compartimentos membranosos interaccionando con organismos simbióticos. (Fig 3).

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de las acuaporinas Bezerra-Neto João P et al. “Plant Aquaporins: Diversity, Evolution and Biotechnological Applications”.

2. ESTRUCTURA

Fig 3 Localización de AQP en las hojas y en las raíces de Mesembryanthemum crystallinum. Amezcua Romero Julio César, Vera Estrella Rosario. “Las plantas y sus acuaporinas”

Fig 2. Algunas funciones

Debido a su abundancia (relativamente alta) en las membranas de las plantas y a pesar de su alta hidrofobicidad, las acuaporinas son fácilmente susceptibles al análisis por espectrometría de masas, esta técnica de alta resolución permite distinguir entre homólogos de acuaporinas muy cercanos. Se descubrieron varias estructuras de acuaporinas a resolución atómica, estos análisis han demostrado que las acuaporinas exhiben unos pliegues y una topología de membrana muy conservados. Aunque cada acuaporina por si sola forma un canal, se ensamblan como tetrámeros que se estabilizan mediante puentes de hidrógeno, esto es así ya que eta estructura confiere una mayor estabilidad a estas proteínas en el entorno lipídico de la membrana. (Fig 4).

Fig 4: Estructura molecular de AQP SoPIP2 de Spinacia oleracea. Maurel Christophe. “Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties”.

Cada uno de los monómeros del tetrámero delimita un poro individual. Los monómeros de acuaporina exhiben seis hélices α transmembrana (H1-H6) y cinco bucles de conexión (A-E) de tal forma que B, D y dominios amino y carboxilo terminal se encuentran ubicados en el lado citosólico y A, C, E en el extracelular. (Fig 5)

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El lazo intracelular B y el extracelular E que portan un triplete asparagina-prolinaalanina (NPA). Esta estructura, se encuentra muy conservada en todas las acuaporinas.

Fig. 5 Esquema de la estructura de un monómero de acuaporina desplegado donde se observan las principales características. Bezerra-Neto João P et al. “Plant Aquaporins: Diversity, Evolution and Biotechnological Applications”.

Las acuaporinas exhiben un pliegue en "reloj de arena", debido a una simetría interna de la molécula los lazos B y E se pliegan como hélices α que atraviesan la mitad de la membrana y se sumergen en la membrana para colocar cada uno de sus motivos NPA en el centro del poro. Esta estructura conforma una zona central estrecha que se ensancha abriéndose hacia ambos lados de la membrana. (Fig 6). Estos dos motivos NPA contribuyen a una constricción del poro central y, junto con el momento dipolar de las dos hélices α que atraviesan la mitad de la membrana, evitan la permeación de protones (H +). Además, aparecen cerca de la salida citosólica del poro cuatro residuos conservados forman una constricción típica aromática /arginina (Ar/R) que funciona como el principal filtro de selectividad de las acuaporinas.

Fig 6. Estructura molecular de un monómero de AQP. Chávez Suárez, Licet et al. “Aspectos de interés sobre las acuaporinas en las plantas”

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3. CLASIFICACIÓN Las acuoporinas vegetales presentan una gran cantidad de isoformas, según la homología de los genes que codifican para estas proteínas en los diferentes vegetales, se han subdividido en 5 subgrupos que de cierto modo corresponden con las diferentes localizaciones subcelulares Las proteínas intrínsecas de tonoplasto (TIP) : se expresan abundantemente en las membranas vacuolares. Las proteínas intrínsecas de la membrana plasmática (PIP) : se expresan en la membrana plasmática. Los PIP se subdividen en dos subgrupos filogenéticos, PIP1 y PIP2. Debido a su abundancia, los PIP y TIP representan vías centrales para el transporte de agua transcelular e intracelular. Un tercer subgrupo comprende proteínas intrínsecas de membrana similares a la Nodulina 26 (NIP) (Nodulin 26-like intrinsic proteins), están presentes en plantas no leguminosas, se han localizado en el plasma y las membranas intracelulares (son homólogas cercanas de Gm Nod26, una acuaporina abundante en la membrana peribacteroide de los nódulos simbióticos fijadores de nitrógeno de las raíces de soja). Las proteínas pequeñas intrínsecas básicas (SIP) definen el cuarto subgrupo de acuaporinas vegetales forman una pequeña clase de 2-3 homólogos de acuaporina divergentes y se localizan principalmente en el retículo endoplásmico (RE). Posteriormente se identificó la XIP (proteína intrínseca X) que están ausentes en algunas especies de plantas superiores como las monocotiledóneas o las Brassicaceae. Todos los sistemas de expresión han revelado que las acuaporinas vegetales son canales multifuncionales, con una amplia gama de perfiles de selectividad La mayoría de los PIP y TIP funcionan como canales de agua eficientes con sustratos adicionales como H2O2 (peróxido de hidrógeno), CO2 para PIP, o NH3 (115, 164) y urea para TIP. Los NIP tienen una actividad de transporte de H2O reducida, son en su mayoría permeables a pequeños solutos orgánicos y nutrientes minerales. En particular, median el transporte de metaloides beneficiosos [B, Si, selenio (Se)] o [arsénico (As), antimonio (Sb)] tóxicos. En los SIP solo se ha caracterizado la función de transporte moderado de H2O y los XIP como canales multifuncionales permeables a agua, metaloides y ROS.

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7. Diagrama esquemático de la localización de las AQP en las plantas. Maeshima, Masayoshi & Ishikawa, Fumiyoshi. “ER membrane aquaporins in plants”. Fig 8. Árbol filogenético de familias de AQPs Arabidopsis (rojo) y de arreoz (negro ). Maurel, Christophe et al. “Aquaporins in Plants.” Fig

4. EVOLUCIÓN DE LAS ACUAPORINAS La evolución molecular por duplicación de genes y la diversificación estructural son la base del marco filogenético de las acuaporinas, pero se ha sugerido la presencia de transferencia horizontal de genes de bacterias a eucariontes y viceversa. Se ha propuesto que las múltiples duplicaciones de las acuaporinas identificables dentro de la familia de las plantas verdes posiblemente estén asociadas con la conquista del medio terrestre. Dendrograma que representa las relaciones estructura-función de las subfamilias de acuaporinas de 23 especies de plantas verdes. La clasificación evolutiva se realiza mediante el LCA (análisis del antepasado común más bajo) que es un método para reconstruir filogenias basado en grupos de genes ortólogos (genes que son copias divergentes de un mismo gen o las secuencias que son similares en diferentes especies por haberse originado de un ancestro común) El análisis de LCA se confirmó la presencia de siete clases de acuaporinas en plantas: TIP ,PIP, NIP, SIP, XIP, HIP y GIP A pesar de esta diversidad, solo cuatro subfamilias principales de AQP (PIP, TIP, NIP y SIP) se distribuyen ampliamente entre plantas superiores.

Subclases como XIP, HIP o GIP se perdieron durante la evolución de ciertos linajes de plantas superiores, por ello han desaparecido en esas y solo se observan en algunas plantas no vasculares

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Fig 9. Dendrograma que representa las subfamilias de AQP de 23 especies diferentes de Viridiplantae. Bezerra-Neto João P et al. “Plant Aquaporins: Diversity, Evolution and Biotechnological Applications”.

Fig 10. Diversificación evolutiva de los grupos de AQPs en las diferentes clases. Bezerra-Neto João P et al. “Plant Aquaporins: Diversity, Evolution and Biotechnological Applications”.

5. REGULACIÓN DE LA FUNCIÓN Las acuaporinas poseen dos estados conformacionales: abierto y cerrado. El paso del estado abierto a cerrado -o viceversa- se conoce como gating, y existen múltiples factores que lo regulan: ● Puentes de hidrógeno que anclan el dominio N-terminal de la proteína con el loop D. ● Fosforilación en el residuo de Ser115 del loop B, que permite soltar al loop D y abrir el canal.

● Unión del cadmio a los aminoácidos Asp28 y Glu31. ● Protonación de His194 del loop D, que gracias a esta se une fuertemente a Asp28, bloqueando así el canal. 8

Mientras que los dos primeros son mecanismos de apertura del canal, los dos últimos son mecanismos de cierre del canal. Abordaremos cada uno de los mecanismos de manera detallada:

5.1. Fosforilación Muchas proteínas intrínsecas de la membrana plasmática (PIP) y proteínas intrínsecas del tonoplasto (PIT) se pueden regular por este mecanismo, cerrándose el canal al ser este fosforilado por proteínas quinasas. Estas fosforilaciones ocurren, preferentemente, en el loop B o en el extremo C-terminal.

5.2. Cationes divalentes Regulan la apertura del canal solo en la cara citosólica de las acuaporinas PIP. El ejemplo más característico es la regulación mediada por calcio, junto a la mediada por cadmio.

5.3. pH Esta regulación es la más importante de todas, puesto que, a medida que disminuye el pH, se produce acidosis, lo que disminuye la actividad de las acuaporinas. Esto implica que hay una relación directa entre el pH y la actividad de las acuaporinas, pero no se conoce si solo ocurre en la raíz, o en toda la planta.

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Como conclusión a esta clasificación, existe una relación entre todos los métodos de regulación, existiendo sinergias y contra regulaciones en este sistema. Por ejemplo, en una célula vegetal, un estímulo produce el aumento de los niveles de calcio. Esto activa a las proteínas quinasas dependientes de calcio, que fosforila al receptor. Pero, este receptor también es activado por iones divalentes -en este caso, el calcio-, por lo que va a estar doblemente activado. Esta “doble-activación” quiere decir que tendrá una mayor actividad que si solo hubiese sido activado por calcio o por fosforilación. Y también se ha de considerar que los procesos serán diferentes dependiendo del grupo vegetal del que estemos hablando. Por ejemplo, altas temperaturas reducen el proceso de fosforilación en las hojas del tulipán, mientras que en las raíces del maíz es a la inversa; mientras que bajas sensibilidades frente al calcio en los canales PIP de las hojas de Arabidopsis, pero alta en estos mismos canales de las raíces de Beta vulgaris.

6. PAPEL DE LAS ACUAPORINAS EN RESPUESTA AL ESTRÉS ABIÓTICO Antes de abordar el tema, hemos de recordar que existen dos tipos de factores que intervienen en los procesos vegetales: ● Factores abióticos. Son aquellos factores causados por fenómenos no biológicos, como el agua, la temperatura, la salinidad, etc. ● Factores bióticos. Son aquellos factores causados por fenómenos biológicos, como la infección por microorganismos. Independientemente del tipo de factor, se producirá una regulación sobre el canal de acuaporinas. Este canal se degrada por ubiquitinación, con el complejo E3, se llevará al proteosoma. O bien, puede almacenarse en vesículas, o llevarse al Aparato de Golgi para producir modificaciones postraduccionales. 10

6.1. Agua El proceso más conocido es el del estrés osmótico. Esto se genera en carencia de agua, y está relacionado con la presencia de ácido abscísico. Este proceso se da en dos partes. En primer lugar, en carencia moderada de agua, se estimula la conductividad hídrica por parte de la raíz, puesto que es necesario crecer la raíz para captar agua; mientras que en condiciones de carencia extrema de agua se reduce la conductividad hídrica, debido a que la raíz no ha de perder agua. Ejemplo de esto son el maíz y el álamo.

Fig 18. Zea mays. “Enciclopedia ilustrada del maíz”

Fig. 19. Populus tremuloides. “Gardenia. Creating gardens”

Esto indica la existencia de un mecanismo muy fino de regulación del estrés hídrico. Como se ha comentado anteriormente, este estrés hídrico genera la ubiquitinación de las acuaporinas, o bien su almacenamiento en vesículas.

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Fig 20. Papel de las acuaporinas en respuesta al estrés osmótico. Maurel, Christophe et al. “Aquaporins in plants”

6.2. Nutrientes Es un proceso complejo, en donde se produce una regulación negativa de las acuaporinas en carencia de alimento. El único nutriente cuya carencia aumenta la conductividad hídrica de la raíz es el potasio. Tanto el etileno como el ABA toman parte en este proceso. Para comprobar este efecto, se realizó un experimento de inhibición y estimulación de los canales PIP de la membrana en presencia de nutrientes y en carencia de uno de ellos -o fósforo o nitrógeno-. Lo que se observó es que al aplicar cloruro de mercurio y ditiotreitol sobre una célula sin estrés nutritivo se observaron efectos sobre los canales. Sin embargo, en carencia de alimentos esta regulación se inhibe, puesto que el organismo vegetal posee mecanismos para poder regular de manera fina la cantidad de agua, disminuyendo la sensibilidad ante estos compuestos para evitar la salida de agua de la raíz.

Fig 23. Regulación de la actividad de las acuaporinas por deprivación de nutrientes. En la imagen se muestra el control azul-, el carente de nitrógeno rojo- y el carente en fósforo verde- en presencia de un activador -DTT- y un inhibidor -HgCl2-. Maurel, Christophe et al. “Aquaporins in plants”

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6.3. Otras señales del suelo Algunas de las señales más importantes aparte de las anteriormente vistas son las altas temperaturas y la carencia de oxígeno. Ambas disminuyen la presencia de canales PIP salvo en la planta del arroz, debido a la expresión de un tipo de acuaporina conocida como OsPIP2;5. La compactación del suelo genera anoxia por acidificación, que genera el gatillado de canales PIP.

6.4. Ritmos circadianos Experimentos realizados con mutantes en condiciones de luz constante o en períodos de día-noche muestran una regulación de canales TIP2 mediada por luz. Esto se conoce debido a que se obtiene el máximo de Lpr durante el día. Los procesos abióticos que regulan las acuaporinas son numerosos, entre los que podemos destacar, aparte de los ya estudiados, el transporte de vesículas en el cloroplasto.

Fig 21. Reloj biológico vegetal. Greenham and McClung 2015 Nature Rev. Genet. 16:598

Los procesos abióticos que regulan las acuaporinas son numerosos, entre los que podemos destacar, aparte de los ya estudiados, el transporte del cloroplasto. Los canales

TIP y PIP serán importantes no solo en el transporte de agua, sino también de otros elementos, como el dióxido de carbono. Este, debido a las membranas del cloroplasto, no podrá difundir libremente a través del cloroplasto, por lo que será gracias a las acuaporinas PIP1 que podrá entrar para llevar a cabo el ciclo de Calvin. También habrá acuaporinas en las membranas tilacoidales, regulando la turgencia y la cantidad de agua en el tilacoide. Este agua, en el lumen de la célula y en presencia de oxígeno, generará moléculas con radicales libres, que han de ser neutralizadas y dar productos inocuos -como el agua oxigenada pero que han de ser igualmente eliminados, pues a altas cantidades puede ser tóxico. Esta expulsión se llevará a cabo por canales PIP2 y TIP. 13

Fig 22. Papel de las acuaporinas regulando el transporte del cloroplasto. Maurel, Christophe et al. “Aquaporins in plants”

7. PAPEL DE LAS ACUAPORINAS EN RESPUESTA AL ESTRÉS BIÓTICO El estrés biótico es aquel llevado a cabo por seres vivos. Destacamos tres tipos fundamentales.

7.1. Simbiosis en leguminosas Se produce una simbiosis entre una leguminosa y una bacteria inespecífica del género Rhizobiaceae. Esta unión produce la diferenciación de la bacteria a una bacteria específica encargada de fijar nitrógeno -del género Rhizobium-, y la formación de unos nódulos. Esto genera que la planta pueda captar una mayor cantidad de nitrógeno, y además, las acuaporinas regularán el intercambio NH3-NH4+.

Fig 23. Transcorte de raíz de soja y nódulo. “Morfología de plantas vasculares”

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7.2. Micorrizas Consisten en la unión de uno o más hongos con las raíces de una planta. Esta unión aumenta la obtención de agua, puesto que las micorrizas toman parte en esta, por lo que las acuaporinas tendrán que mostrar una mayor resistencia al estrés hídrico.

7.3. Infecciones patógenas Son llevadas a cabo por un numeroso grupo de bacterias Gram-negativas. Destaca Xanthomonas oryzae. Esta infección patógena se llevará a cabo de tres maneras: bien por HrpF, factor secretado por la ya mencionada anteriormente X. oryzae, bien por endocitosis de membrana, o bien por las acuaporinas. En el caso de llevarse a cabo por acuaporinas, será la acuaporina OsPIP1;3 la que tiene un papel más importante en la regulación de la toma de agua de la planta. Al unirse el efector de translocación de tipo III que secreta la bacteria al receptor de membrana e interaccionar con la acuaporina, se produce la transcripción de factores de virulencia asociados al efector TAL PthXo1. Este es un factor virulento, puesto que causa una respuesta de infección. Pero también existen los factores no virulentos, que además que no causan una infección, producen inmunidad. Este es el caso de AvrXa10, que al ser modificado y generar un recombinante que la planta tome, es capaz de ser resistente al tizón. Todos estos procesos pueden ser llevados a cabo por las acuaporinas, puesto que son las que translocan los factores E3 al interior celular, y además pueden funcionar como sensores de sensibilidad de las plantas, dependiendo si es una respuesta virulenta o no.

Fig 24. Transporte del efector T3 a través de la membrana. Este transporte puede llevarse a cabo mediante un poro -vía negra-, mediante un translocon -vía morada- o mediante endocitosis -vía roja-. Zhang, L. “Plant aquaporins in infections by and immunity against pathogens -a critical review-”.

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8. IDENTIFICACIÓN, CARACTERIZACIÓN Y ENFOQUES BIOTECNOLÓGICOS. 8.1 Identificación y caracterización de acuaporinas Con las tecnologías NGS (secuenciación de nueva generación) se ha podido realizar estudios integrales de los genes de l...