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Replicación y reparación del ADN...

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B11 -Replicación y Reparación del ADN Jueves 12 de abril, 2018 8:00 – 11:50 Dr. Warner Alpízar Alpízar

Imagen 1. Flujo de la información genética

Es el proceso mediante el cual una hebra doble de ADN da lugar a dos copias idénticas de la molécula. En este proceso participan enzimas que llevan a cabo la síntesis del ADN de una forma muy rápida y eficiente. Durante la replicación pueden ocurrir errores, sin embargo, la probabilidad es bastante baja; además, nuestras células cuentan con mecanismos de reparación de ADN (el ADN es la única macromolécula que cuenta con estos mecanismos de reparación, los cuales varían en función del tipo de daño) muy especializados y altamente capacitados para revisar, detectar y corregir errores que puedan surgir durante el proceso.

Pero esto no significa que estemos exentos de sufrir imperfecciones a la hora de la replicación de nuestro ADN por un posible fallo en estos mecanismos, lo cual puede causar una pérdida del funcionamiento de los genes; si estos cambios que causan errores son heredables, el error se vuelve permanente y se transmite a las células hijas. Peor aún, si la célula defectuosa es una célula germinal, puede ser heredable (mutación hereditaria). Propiedades básicas de la replicación del ADN La replicación del ADN cumple una serie de reglas fundamentales, las cuales aplican para cualquier especie: 1. Es un proceso semiconservativo (imagen 2), lo cual quiere decir que cada hebra sirve como molde para sintetizar una hebra nueva, por el código de unión de nucleótidos. Esto garantiza que las dos moléculas nuevas sean idénticas a la que les dio origen. Ambas hebras son replicadas de forma simultánea (afirmación que está siendo cuestionada en estudios actuales; lo que sí es cierto es que la síntesis de ambas moléculas finaliza al mismo tiempo). 2. La replicación inicia en un sitio específico llamado origen (OriC), el cual es reconocido por proteínas específicas que se unen al sitio para que inicie el proceso. Además, la replicación se realiza bidireccionalmente; existen puntos dinámicos denominados horquillas de replicación, los cuales son los puntos donde ocurre la replicación. Al ser un proceso bidireccional, del origen surgen dos horquillas de replicación que se alejan del origen en direcciones opuestas y se desplazan a través del ADN. (imagen 3) 3. La síntesis del ADN procede en dirección de 5´ a 3´, la lectura de la hebra molde se realiza de 3´ a 5´, por ser hebras antiparalelas. Se dice que es un proceso semidiscontinuo, ya que siempre habrá una hebra nueva que se sintetice continuamente (hebra líder) y otra hebra nueva que se sintetice discontinuamente, por fragmentos (hebra rezagada); los fragmentos formado en la síntesis de la hebra rezagada reciben el nombre de fragmentos de Okazaki. Esta hebra se sintetiza de este modo debido a que tiene que esperar a que la molécula original se vaya abriendo para continuar el proceso y que se cumpla el principio de sintetizar la hebra en la dirección de 5´a 3´. (imagen 4)

Imagen 2. Semiconservación del ADN.

Imagen 3. Replicación del ADN inicia en un sitio de origen y procede bidireccionalmente.

Imagen 4. Replicación es un proceso semidiscontinuo y procede en dirección de 5´a 3´. Lectura de hebra molde se da en dirección de 3´a 5´.

Degradación del ADN Los procariotas poseen un mecanismo de defensa que consiste en que ciertas enzimas son capaces de degradar ácidos nucleicos, esto con el fin de destruir ADN foráneo que haya penetrado su organismo y que resulte patógeno. Los eucariotas no contamos con este mecanismo de protección, ya que no sintetizamos estas enzimas, conocidas como nucleasas. Las nucleasas pueden ser ADNasas o ARNasas y cada uno de estos tipos se puede dividir en: •

Endonucleasas: inician la degradación del ADN en sitios específicos a lo interno de la molécula, reconociendo secuencias específicas de ácidos nucleicos y forman fragmentos de tamaño variable. (imagen 5)

•

Exonucleasas: degradan los ácidos nucleicos iniciando en los extremos terminales (5´o 3´), hacia dentro de la molécula. (imagen 5)

Imagen 5. Endonucleasa y exonucleasa.

Replicación del ADN La síntesis de las hebras nuevas de ADN es llevada a cabo por un grupo de enzimas llamadas ADN polimerasas, que como su nombre lo dice, forman polímeros de nucleótidos. Ellas pegan nucleótidos a una cadena de ADN que ya existe, es decir, extienden una cadena de nucleótidos ya existente. La polimerasa une desoxinucleósidos trifosfato (dNTP) a esta plantilla de nucleótidos ya existente (hebra molde), por lo que la polimerasa lo que ocupa para realizar la formación de la hebra nueva es una plantilla o fragmento preformado y dNTP, los cuales va pegando uno a uno, pero sumamente rápido. Cuando une el nucleótido a la plantilla, debe quitarle dos fosfatos al dNTP para obtener la energía necesaria para que se forme el enlace fosfodiéster entre él y el nucleótido de la plantilla y

que se junte uno con el otro. De esta forma la cadena crece un nucleótido cada vez que esto se lleva a cabo y este nucleótido queda con un solo fosfato (dNMP). Los dos fosfatos que se desprenden del nucleótido salen en forma de grupo pirofosfato (PPi).

(dNMP)n + dNTP -------> (dNMP)n+1 + PPi

•

En la bacteria E. Coli existen al menos cinco tipos de ADN polimerasas.

Importante recordar: Todas las ADN polimerasas requieren de una hebra molde y solo pueden adherir nucleótidos (no pueden crear una hebra nueva), por lo que necesitan también una plantilla corta, que es complementaria a la hebra molde, a partir de la cual van a empezar a unir los nucleótidos. Este segmento corto es de ARN y se conoce como primer (iniciador). El primer es sintetizado por la enzima primasa, la cual no requiere de un molde. La hebra molde y el primer son fundamentales para que las ADN polimerasas realicen el proceso. La ADN polimerasa alarga el primer al leer el nucleótido que está en la hebra molde y le pega el nucleótido complementario, gracias a la formación de puentes de hidrógeno entre ellos. Para unir el desoxinucleótido al ribonucleótido del primer se da un ataque nucleofílico, en el cual es fundamental el magnesio como un cofactor enzimático que permite que se dé el acercamiento del desoxirribonucleótido trifosfato a la cadena en formación y que se rompa el enlace fosfodiéster de éste. Procesividad: Número promedio de nucleótidos que son adheridos por la ADN polimerasa antes de que se disocie. Mide la efectividad de esta enzima, lo cual varía de un tipo de polimerasa a otra. La ADN polimerasa discrimina entre el nucleótido que se debe unir a un nucleótido específico y el que no. Si el que pretende unirse es incorrecto, la base es expulsada antes de que se forme el enlace fosfodiéster. Además, esta enzima tiene actividad exonucleasa de 3´a 5´, revisando cada nucleósido después de haber sido adherido; si encuentra un error se devuelve y lo corrige con el sitio activo de tipo exonucleasa. El inconveniente es que la enzima es capaz de corregir únicamente el último

nucleótido que pegó, si más atrás había pegado uno incorrecto y no lo corrigió, ya no se puede devolver y queda mal. *Recordar: la parte con la que la ADN polimerasa adhiere los nucleótidos (de 5´a 3´) es el sitio activo polimerasa y la parte con la que corrige un nucleótido incorrecto (de 3´a 5´) es el sitio activo exonucleasa. ADN polimerasas en procariotas •

ADN polimerasa I: realiza funciones de limpieza durante la replicación, la recombinación (intercambio de fragmentos entre cromosomas homólogos) y la reparación. Es la única que posee actividad exonucleasa en dirección de 3´a 5´ y de 5´a 3´, corrige de atrás hacia delante y de adelante hacia atrás. Se encarga también de eliminar los primer por estar formados de ARN y no ser funcionales, porque lo que se está sintetizando es ADN.

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ADN polimerasa II: involucrada principalmente en la reparación del ADN, corrige de 3´a 5´.

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ADN polimerasa III: principal enzima que participa en el mecanismo de replicación. Es la más grande, más rápida y la que más trabajo realiza. Puede adherir hasta 1000 nucleótidos por segundo, mientras que la I solamente entre 10 y 20 y la II 4  0 por segundo. Además, es capaz de pegar hasta 1 millón de nucleótidos antes de disociarse.

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ADN polimerasas IV y V: participan en reparaciones inusuales del ADN.

Cada fragmento de Okazaki tiene en su inicio un primer, el cual es removido por el sitio activo exonucleasa (de 5´a 3´) de la ADN polimerasa I, que conforme va quitando los ribonucleótidos del primer, va agregando los desoxiribonucleótidos complementarios a los de la hebra molde (reemplaza rN por dN) , utilizando el fragmento de Okazaki anterior como primer para este proceso. La ADN polimerasa III posee al menos 10 subunidades. Si se observa la imagen 6, la hebra molde está metida en la “argolla” de color azul-morado (subunidad beta), por esta razón casi nunca se cae, lo que favorece la procesividad. De este modo, la subunidad con actividad polimerasa (color amarillo) va adhiriendo los nucleótidos y formando la hebra nueva. Las subunidades verdes se encargan de colocar la subunidad beta de forma que la hebra molde quede dentro de ella y, conforme va saliendo, se desdobla para que se sintetice la hebra nueva. La síntesis de la hebra líder y de la rezagada es llevada a cabo por la misma enzima ADN polimerasa III, cada una con una subunidad con actividad polimerasa de esta enzima.

Imagen 6. Estructura de la ADN polimerasa.

Sistema de replicación de ADN Se requieren al menos 20 enzimas y factores para llevar a cabo este proceso: Helicasas: separan las hebras de ADN utilizando energía de la hidrólisis de ATP. La apertura de la doble hélice genera estrés topológico (ambas hebras se enredan). •

Topoisomerasas: eliminan el superenrollamiento generado por la apertura de l estructura helicoidal del ADN. Hay de dos tipos (imagen 7): ✓ Tipo I: corta solo una hebra, elimina el superenrollamiento y la vuelve a unir. ✓ Tipo II: corta ambas hebras, elimina el super enrollamiento y las vuelve a unir.

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Proteínas de unión del ADN hebra simple (SSB): estabilizan las hebras una vez que éstas han sido separadas por la helicasa, evitan que se vuelvan a unir.

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Primasas: sintetizan el iniciador necesario (primer) para que las ADN polimerasas comiencen la síntesis de hebras nuevas.

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Ligasas: forman los enlaces fosfodiéster últimos para unir cada fragmento de Okazaki sintetizado por la ADN polimerasa en la hebra rezagada

Imagen 7. Tipos de proteínas topoisomerasas.

 Algunos datos importantes: ✓ La enzima primasa sintetiza los primer en dirección de 3´ a 5´. ✓ La hebra líder ocupa solamente un primer al principio, por sintetizarse de manera continua. ✓ La hebra rezagada ocupa muchos primer, uno cada vez que va a formar un fragmento de Okazaki. ✓ La primasa que sintetiza el primer de la hebra líder no es necesariamente el mismo que sintetiza los primer de la rezagada. ✓ Los primer son necesariamente complementarios a la hebra molde, ya que la primasa reconoce los nucleótidos de la hebra molde y sintetiza lo complementario. Fases de la replicación 1. INICIACIÓN Se da la apertura del ADN en el sitio de origen específico (Ori u OriC) y se ensambla el complejo preiniciador (proteína DnaA). La apertura y unión de estas proteínas ocurre en regiones específicas del Ori llamados sitios R y elementos DUE (ricos en A=T). El siguiente proceso quedará mejor explicado con la imagen 8: La DnaA se une a los sitios R (azul), con ayuda de ATP, esto produce un enrollamiento que provoca que el sitio DUE (anaranjado) se abra y ambas hebras se separen.* La proteína DnaC está unida a la DnaB (helicasa) y le ayuda a “sentarse” en la apertura sobre las hebras para que continúe la apertura, esto con ayuda también de ATP. Cundo la helicasa está ya en su lugar, la DnaC se separa de ella y se va. En este momento llega la primasa, pero inicia la síntesis del primer en la elongación. Una vez formada la horquilla de replicación se adhieren proteínas de unión al ADN (SSB), topoisomerasas y ADN polimerasa III.

*Como se mencionó antes, la proteína DnaB (helicasa) es la que se encarga de ir abriendo la doble hélice para que se dé la replicación; sin embargo, la DnaA realiza primeramente la apertura y la helicasa continúa abriendo.

Imagen 8. Proceso de iniciación del sistema de replicación de ADN.

Imagen 9. Proteínas presentes en la fase de iniciación de la replicación de ADN.

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Posible pregunta de examen: ¿Cuáles proteínas están presentes en la fase de iniciación de la

replicación de ADN? Respuesta: DnaA, DnaB, DnaC, DnaG (primasa).

2. ELONGACIÓN Se da la síntesis de ambas hebras nuevas de ADN de forma simultánea. Inicia con la síntesis del primer de ARN por parte de la primasa. Los desoxiribonucleótidos trifosfato son adheridos por la ADNpolimerasa III (alarga el primer). Una vez que se completa el fragmento de Okazaki ( aproximadamente de 1000 nucleótidos) la ADN polimerasa I remueve el primer (nucleótidos de ARN) y pone los nucleótidos de AND, en dirección de 5´a 3´. En la hebra líder, como solo hay un primer al inicio, se ocupa solamente la ligasa una vez, la cual une ambos fragmentos por enlace fosfodiéster. >Nick: espacio que queda entre primer y fragmento de Okazaki anterior, lo elimina la ligasa. >Replisoma: conjunto de todas las proteínas que conforman el complejo de replicación en la elongación. (Revisar con detenimiento las proteínas que conforman el replisoma, imagen)

Imagen 10. Proteínas presentes en el replisoma.

3. TERMINACIÓN Secuencias específicas de nucleótidos (Ter) marcan la terminación del mecanismo de la replicación (aparecen múltiples secuencias iguales de nucleótidos que indican que se va a acabar la replicación). A las Ter se unen proteínas llamadas Tus (complejo Ter-Tus) para ir “desacelerando el proceso”, provocando que el replisoma se caiga.

Imagen 11. Fase de terminación de la replicación de ADN.

La replicación en células eucariotas: En comparación al proceso de las células procariotas, la replicación de las células eucariotas sigue el mismo proceso y las mismas fases. El profesor menciona que es como “la otra versión de una misma película”; es decir, la trama se mantiene, lo que cambian son los actores. La diferencia más notable es la forma y compactación del ADN eucariota: al ser más largo que el ADN bacteriano (circular), se compacta alrededor de histonas para formas cromosomas. Por lo tanto, en la replicación es necesario desdoblar el ADN alrededor de las histonas para poder replicarlo. Fases de la replicación eucariota: Para iniciar la replicación se requiere la formación de un complejo proteico, llamado Complejo de reconocimiento del origen (ORC), el cual es el equivalente a la proteína DnaA involucrada en la replicación procariota. Este complejo se une a las secuencias de origen de las hebras de ADN, distribuidasa lo largo de las helices; formando múltiples horquillas de replicación. Este es el encargado de crear la separación inicial para montar las helicasas (no son iguales a las de las procariotas, pero, cumplen la misma función) y seguir dividiendo las hélices. La replicación ocurre también bidireccionalmente; por lo que, el proceso se termina al “chocar” los dos replisomas.

Imagen 11.

Igualmente, las replicaciones se distinguen por los diferentes tipos de ADNpol: -

ADNpol alfa (α): Una subunidad cumple la actividad de la primasa, sintetiza los “primers” de ARN; sin embargo, a diferencia de la primasa procariota, los sintetiza de 5’a 3’. Además, esta no posee actividad como exonuclesasa (capacidad de corrección). Aunque otra subunidad realiza una función de polimerasa, para el profesor solo se tomará en cuenta la función de primasa.

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ADNpol delta (δ): El equivalente a la ADNpol III, lleva a cabo la extensión de las hebras de ADN (especializada en la hebra rezagada); para su funcionamiento ocupa al PCNA (Antígeno

Nuclear de Proliferación Celular) para “anclar” la hebra de ADN (equivalente a la subunidad β de ADNpol III que funciona como garra). Tiene actividad como exonucleasa de 3’a 5’. Con técnicas de inmunohistoquímica se busca la presencia de PCNA, ya que esto significaría que las células están en un estado proliferativo. -

ADNpol épsilon (ε): Encargado de la extensión de la hebra líder. Tiene actividad exonucleasa de 3’a 5’

-

Otras ADN pol: γ para la replicación de ADN mitocondrial y otras 5 para la reparación: Beta, n, l, k,ξ. (no se entró en detalles en clase)

Del mismo modo, otra diferencia son las enzimas que remplazan a las ADNpol I para la “limpieza” de los primers, estas son las flap endonucleasa-1 o (FEN1). Pero, a diferencia de la ADNpol I estas no pueden remplazar los ribonucleótidos que removió; estos son remplazados por la ADNpol δ. Además las proteínas SSB se remplazan por RPAs, para mantener las hebras separadas. La ligasa si permanece siendo la responsable de cerrar los espacios que se crean entre fragmentos.

La terminación es la etapa donde se presentan las mayores diferencias, ya que el ADN eucariota no es circular; por lo tanto, en esta etapa es necesaria la síntesis de unas estructuras especiales llamadas telómeros. Las secuencias teloméricas son muy repetitivas, entonces las polimerasas al encontrárselas se confunden y se “caen” de la hebras; por lo que la hebra se va acortando. En la etapa embrionaria, en las células germinales y en las células madre se encuentran las telomerasas (enzimas especiales que se componen de proteína y de ARN), las cuales regeneran los telómeros acortados durante la replicación. En las células donde esta enzima no se encuentra, debido al acortamiento de los telómeros, el ADN se va desprotegiendo gradualmente, provocando que cuando la célula este muy desprotegida, entra en apoptosis. La célula está programada para reproducirse un número umbral de veces, luego de esas muere. Este fenómeno esta relacionado con el envejecimiento; y, con el cáncer, ya que la mayoría de células cancerígenas si presentan actividad telomerasa, de ahí su éxito.

Pol α Imagen 12.

Cuadro I. Procariota Función Punto de origen Separar hebras

Replisoma

Sintetizar primers Extender hebras Quitar primers Remplazar primers Ligar espacios entre fragmentos Proteínas para mantener hebras separadas Eliminar estrés topológico Secuencia de terminación

Responsable DnaA Helicasa (ayuda de DnaC) Primasa ADNpol III

Eucariota

Actv. Exonucleasa -

Responsable ORC

Actv. Exonucleasa -

-

Helicasa

-

De 3’ a 5’ De 3’a 5’ de 5’a 3’

ADNpol α ADNpol (δ/ε) FEN-1 ADNpol δ

De 3’a 5’ De 3’a 5’

Ligasa

-

Ligasa

-

SSB

-

RPA

-

Topoisomerasas (I/II)

-

Ter (ADN circular)

-

ADNpol I

Topoisomerasas (I/II) Telómeros (final de hebras)

-

La reparación de ADN: El ADN es la única macromolécula para la cual existen mecanismos de reparación, ya que este es irremplazable y puede dañarse por muchos factores, hasta el mismo proceso de replicación puede inducir errores. Los agentes externos son los que producen la mayoría de los errores (por rayos UV, químicos, radiaciones ionizantes, preservantes).

Transformaciones no enzimáticas: 1) Pérdida espontanea de grupos amino (deaminación):Las bases nitrogenadas pierden parte de sus grupos aminos 2) Hidrólisis de bases nitrogenadas (depurinación): Pérdida de toda la base nitrogenada del ácido nucleico 3) Reacciones provocadas por luz UV, radioactividad o químicos: apertura de anillos de...