BE1 Problemas P7 PDF

Preview

Summary

problemas practica 7...

Description

PROBLEMAS DE PRÁCTICA 7: Separación de proteínas mediante cromatografía de filtración en gel. Determinación de la masa molecular. Kiara Padilla Cubas Correo: [email protected]

3º Bioquímica, UCO Bioquímica experimental

a) Una muestra contiene las proteínas indicadas a continuación. Razonar cuál(es) de los componentes se podrá(n) separar en una columna rellena con Sephadex G-100. Lactoferrina: 77 kDa Proteína ligante de retinol (RBP): 21 kDa Lisozima: 15 kDa Ceruloplasmina: 134 kDa Glutatión: 333 Da Límite de exclusión para proteínas globulares: 100 kDa. Intervalo de fraccionamiento para proteínas globulares: 4-100 kDa

En este caso se pueden separar todas la proteínas, puesto que las proteínas que no están dentro del intervalo de fraccionamiento de la columna son la ceruloplasmina y el glutatión que salen en el volumen de vacío y total respectivamente. Es decir: Primero saldría el glutatión en el volumen total, ya que su peso molecular es inferior al del límite inferior de nuestra columna. Después se separan proporcionalmente al log de su peso molecular las proteínas cuyo peso molecular está dentro del intervalo de fraccionamiento de la columna: Lactoferina, RBP y lisozima (en este orden de mayor a menor peso molecular). Finalmente sale la ceruloplasmina en el volumen de vacío, puesto que su peso molecular supera el límite superior de la columna. b) Tras un proceso de purificación que partió de un extracto celular, el cromatograma de exclusión obtenido con la muestra resultante indicó la presencia de 2 proteínas diferentes. Calcule cuál es su masa molecular, a partir de los datos de volumen de elución (Ve) obtenidos con la mezcla de proteínas patrón cromatografiada bajo las mismas condiciones.

BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL I

Proteína

Masa molecular

Vo

Aldolasa

39,2 kDa

24 ml

Seroalbúmina

66,2 kDa

21,3 ml

Fosforilasa b

97 kDa

18 ml

ß-galactosidasa

116 kDa

16,5 ml

miosina

212 kDa

14 ml

1

Utilizando la fórmula realizamos los siguientes cálculos para hallar el PM: Primer pico: 15,5 = -14,302x + 46,749; x= 2,185; Pm= 153,1 kDa Segundo pico: 20= -14,302x + 46,749; x= 1,87; Pm= 74,1 kDa c) Estos son los resultados de una cromatografía de exclusión molecular. El intervalo de exclusión de la columna es de 30000-300000 Da. Calcula: Vo Vt Kav para cada columna -

Proteína

Masa molecular

Ve

Ferritina

440000 Da

7,5 ml

Catalasa

250000 Da

12,5 ml

Albúmina

66500 Da

14 ml

Ribonucleasa A

13700 Da

18 ml

En este caso el volumen de vacío se corresponde con el volumen de elución de la Ferritinina ya que su peso molecular supera al límete superior de nuestra columna: Vo= Ve Ferritinina = 7,5 ml.

BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL I

2

En cuanto al volumen total, se corresponde con el volumen de elución de la Ribonucleasa A, ya que su peso molecular está por debajo del límite inferior de nuestra columna: Vt= Ve Ribonucleasa A= 18 ml. Aplicando la siguiente fórmula obtenemos el Kav de las distintas proteínas: Kav= (ve - vo)/(vt - vo) • Ferritina: (7,5- 7,5)/(18-7,5) = 0 •

Catalasa: (12,5-7,5)/(18-7,5) = 0,48 Albúmina: (14-7,5)/(18-7,5) = 0,62

•

Ribonucleasa A: (18-7,5)/(18-7,5) = 1

•

BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL I

3...