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La centrifugation Si on laisse reposer une suspension solide (sable et polystyrène) dans une phase liquide, on observe que les particules, sous l'action de la pesanteur et de la poussée d'Archimède, tendent à tomber vers le fond (sédimentation) ou à remonter vers la surface, selon leur densité et leur taille. Dans certains cas (fluides biologiques, extraits cellulaires) et dans les liquides particulièrement visqueux la sédimentation est relativement lente pour les très fines particules qui sont sensibles à l'agitation thermique.

On a donc eu l'idée d’augmenter le pouvoir séparateur du champ de pesanteur vertical en lui substituant un champ centrifuge radial. Une centrifugeuse est constituée d’une chambre de centrifugation dans laquelle sort l’axe de rotation, qui est relié au moteur. Sur l’axe on fixe le rotor et dans les emplacements du rotor on met les éprouvettes contenants l’échantillon à centrifuger. Quand la centrifugeuse atteint la vitesse de centrifugation désirée, l’échantillon est soumis à un mouvement circulaire uniforme. La vitesse de rotation ou vitesse angulaire (w, exprimé en rad sec-1 ; rpm est la fréquence de rotation en tour par min) est : L’accélération centrifuge ou champ centrifuge, généré par le mouvement circulaire uniforme, est dirigé radialement vers l’extérieure et dépend de la vitesse angulaire (w) et de la distance (r en cm) de l’axe de rotation, selon l'équation : Et sur l’échantillon s’exerce une force centrifuge qui dépend du champ centrifuge (ou accélération centrifuge) et de la masse de la particule : I. La force centrifuge relative La force centrifuge (Fc) qui agit sur l’échantillon dépend de sa masse (m), de la vitesse angulaire (w) et de distance (r) de l’axe de rotation, selon l'équation : Etant donné que tous les corps sur terre sont soumis à la force de gravité on peut définir le Champ Centrifuge Relative (RCF, relative centrifugal field) comme le rapport entre la force centrifuge appliquée par la centrifugeuse sur la particule et la force de gravité (Fg = mg où g = 981cm sec-2 ).

Le Champ Centrifuge Relatif est exprimé en nombre de g mais il n’a pas de dimension (NB. ω2 = rad2sec-2 - le rad n’est pas une dimension). Il nous indique le nombre de g nécessaire pour sédimenter ou séparer une particule. Si l’on exprime la vitesse angulaire (sec-1) en utilisant les tours par minute (rpm) et on substitue à g sa valeur (981cm sec-2), on obtient :

Le Champ Centrifuge Relatif nous dit de combien de fois le champ d’accélération centrifuge doit être multiple de l’accélération gravitationnelle. RCF est donc une valeur absolue à laquelle je soumets la particule pour la séparation. Par la formule nous mettons cette valeur en relation avec la vitesse de la centrifugeuse (vitesse de rotation en rpm) et le rayon du rotor. II. Vitesse de sédimentation La vitesse de sédimentation d’une particule en solution dépend de : la masse de la particule (volume Vp et densité volumique de masse Pp), de la densité volumique de masse (Psol) et viscosité (h) de la solution et de la forme de la particule. La force de sédimentation Fs qui s’exerce sur une particule en mouvement dans une solution est égale à la force de centrifugation moins la force de flottaison (Poussé d’Archimède PA) exercé par la solution :

Cependant une particule qui se déplace dans une solution est soumise à la force de friction, qui s’oppose à son mouvement, et qui e loi de Stokes

La force de friction qui s’oppose au mouvement d’une particule non sphérique dans une solution est : Quand la centrifugeuse atteint la vitesse de centrifugation désirée (le rotor n’accélère plus), la particule atteint la vitesse terminale. La particule n’accélère plus -> la force résultante sur la particule est nulle -> force de sédimentation et la force de friction s'équilibrent et le mouvement est rectiligne uniforme :

La vitesse à laquelle sédimente une particule dépend de la loi de Stokes.

La vitesse de sédimentation est directement proportionnelle : - au volume de la particule - au champ centrifuge (accélération centrifuge) - à la différence de densité volumique de masse entre la particule et la solution - inversement proportionnelle au coefficient de friction (forme particule + viscosité sol.) Pour qu’une particule puisse être sédimenté dans une certaine solution : Si la densité de la particule est égale à celle de la solution, alors la vitesse de sédimentation est nulle et la particule ne sédimente pas :

Deux particules (p1 et p2) se séparent si leur densité est différente (Pp), si leur taille est différente (volume V), si leur forme est différente (a). III. Coefficient de sédimentation Le coefficient de sédimentation :

Les unité de mesure du coefficient de sédimentation sont les secondes et comme la majorité des molécules d’intérêt biologique ont un s supérieur à 10-13 sec, cette quantité est définie une unité Svedberg du nom du chercheur qui l’a défini -> 1 S = 10-13 sec Quand le coefficient de sédimentation est exprimé en Svedberg il est indiqué avec S IV.

Temps de sédimentation

Il est maintenant possible calculer le temps nécessaire pour sédimenter une particule de coefficient de sédimentation connu. Si rt et r0 sont le rayon maximale au fond du tube et le rayon minimale au sommet du tube, alors T=tt-t0 est le temps nécessaire pour sédimenter la particule de coefficient de sédimentation S.

L’unité de mesure du temps de sédimentation est l’heure mais le calcul donne des secondes. V. Centrifugation différentielle La centrifugation différentielle se base sur les différences de vitesse de sédimentation entre particules qui différent par densité et dimensions ; la centrifugation sédimentera d’abord les particules les plus grandes, puis les plus petites. Si deux particules ont même volume (taille) mais différente densité, alors les plus dense sédimenterons plus rapidement que les moins dense.

Par cette technique on effectue des sédimentations complètes, c’est à dire on forme des culots. Le temps nécessaire à la centrifugation est déterminé par le coefficient de sédimentation de la particule à sédimenter -> limite de sédimentation. Par cette technique pas des fractions pures car toutes les composants se retrouvent à rmin et à rmax.

VI. Centrifugation en gradient de densité Pour séparer des particules biologiques de taille similaire mais de densité différente, on utilise de préférence les techniques d’ultracentrifugation en gradient de densité. Les gradients utilisés peuvent être discontinus ou continus :

L’échantillon est chargé en haut d’un gradient, les particules ne sont pas sédimentées au fond du tube en éliminant ainsi les problèmes de co-sédimentation. VII. Centrifugation de zone (isocinétique) Echantillon déposé sur un gradient de pente faible (15 – 30% de saccharose ou glycérol) -> la densité majeur du gradient doit être inférieure à celle de la molécule la moins dense. Cette technique sépare les organelles cellulaires en fonction de leur vitesse de sédimentation. Pendant la centrifugation, chaque particule traverse le gradient avec une vitesse qui dépend essentiellement de son coefficient de sédimentation -> bandes bien distinctes. La centrifugation est arrêtée avant la sédimentation (temps court, vitesse lente) -> sédimentation incomplète.

Méthode de choix pour séparer organelles ou macromolécules qui différent en taille. Les organelles qui ont densités différentes mais taille similaires (mitochondries, lysosomes et peroxysomes) ne sont pas séparées par cette méthode.

VIII. Centrifugation à l’équilibre de sédimentation (isopycnique) Dans cette technique l’échantillon est déposé sur un gradient de forte pente où la densité majeur du gradient est supérieure à celle de la molécule la plus dense. Pendant la centrifugation, chaque type de particule traverse le gradient avec une vitesse qui dépend essentiellement de sa densité jusqu’à attendre la zone du gradient où sa densité est égale à celle de la solution -> vitesse de sédimentation nulle -> bandes bien distinctes. La centrifugation est complète jusqu’à l’équilibre. Grande vitesse de centrifugation, temps de centrifugation long.

Cette méthode est donc de choix pour séparer des organelles ou des macromolécules de même taille mais densité différente. IX. Centrifugeuse : types et caractéristiques Les centrifugeuses peuvent être subdivisées en deux grands groupes : les centrifugeuses de paillasse et les centrifugeuses de sol. Les centrifugeuses de paillasse -> petites (petits,moyens volumes) -> basse et moyenne vitesse. Elles peuvent ou pas être réfrigéré. Les centrifugeuses de sol -> grandes (moyens et grands volumes) -> basse, moyenne et haute vitesse. Elles sont réfrigérées. Les ultracentrifugeuses sont équipées de pompes à vide. X. Centrifugeuse : différents types de rotors Les rotors plus communément utilisés sont les rotors à angle fixe et à angle mobile ou à godets oscillants. Rotors à angle fixe : 20° < angle < 40° Rotors très utilisés pour la sédimentation : technique de centrifugation différentielle. Le particules sont projetées contre la paroi -> formation du culot par glissement Rotors à godets oscillants : ces types de rotors permettent la formation de bandes bien définies et de culots plus homogènes. Ils sont très utilisés pour la centrifugation isocinétique et la centrifugation isopycnique. Petite capacité de charge, délicats d’utilisation. Il faut toujours équilibrer le rotor...