GP1 - Centrifugation Differentielle PDF

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Vlajnic Jules, Pellegrini Mia, Sheikh Mohammad Sarah - CBSVT1 - 2020/2021

Technique : centrifugation différentielle On remarque que le COVID touche beaucoup plus les personnes âgées que les personnes jeunes. Nous pouvons émettre l’hypothèse que le coronavirus pourrait avoir un effet directement sur les mitochondries, puisqu’elles ont tendance à perdre leurs fonctions lors du processus du vieillissement. Pour vérifier cela, nous allons devoir isoler ces mitochondries à partir de différents échantillons : patients âgés et jeunes (malades et sains).

But Le but de cette technique est la séparation des organites présent dans une substance en plusieurs fractions, grâce à une force centrifuge. L’appareil utilisé est une centrifugeuse.

Principe Schéma 1 : Principe de la centrifugation différentielle La centrifugation permet la séparation des organites présent dans une substance en fonction de leur taille, forme et densité grâce à un mouvement de rotation rapide; à des vitesses différente et des temps précis (schéma 1). Tous les organites contenus dans un échantillon sont soumis à la gravité (du haut vers le bas), et à la poussée d’Archimède (du bas vers le haut). Mais en faisant tourner l'échantillon, une nouvelle force apparait, la force centrifuge, qui est une accélération qui s'exerce vers l'extérieur de l'axe de rotation (schéma 2). Cette force centrifuge sera à l’origine de la sédimentation des différents éléments. Vitesse angulaire

Formule de la force centrifuge

Poussée d’Archimède Force centrifuge

Force centripète Force de gravité (pesanteur) Rayon (du tube à l’axe de rotation)

Schéma 2 : Les différentes forces mises en jeu lors de la centrifugation

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Vlajnic Jules, Pellegrini Mia, Sheikh Mohammad Sarah - CBSVT1 - 2020/2021 Chaque organites possède une vitesse de sédimentation propre à lui en raison de ses propriété physique, chimique et biologique. De ce fait, ils n’arrivent pas tous à se déposer au fond du tube de la même façon, ceci est refléter par des coefficient de sédimentation divers (généralement exprimer en Svedberg).

Formule du coefficient de sédimentation

La méthode repose sur le principe de la sédimentation. Selon ce principe, les organites ayant une densité élevée se déposent au fond du tube et vont former le culot, tandis que les autres composant du milieu dont la taille est plus petite resteront en suspension et forment le surnageant. La vitesse avec laquelle se déplacent ces organites est proportionnelle à :

• • • •

La force gravitationnelle à laquelle l’organite est soumis. La masse de l’organite La différence entre la densité de l’organite et celle du solvant, et inversement proportionnelle. La friction avec le milieu, en fonction de la taille et du volume des organites.

Matériel

- Echantillons de patients sains et malades (âgées et jeunes) - Pipettes ou micropipettes : dépendant de la quantité de liquide à déplacer

- Centrifugeuse : ultracentrifugeuse (munis de pompe à vide

Micro - ultracentrifugeuse

et d’un système de réfrigération pour éviter le réchauffement des échantillons) - Tubes à essais spécifiques (tubes à centrifuger conique) : prévient les déversements ou pertes d’échantillons, garantit la compatibilité chimique, il existe des facteurs de sélection du tube • Rotors (à godets oscillants, à angle fixe et verticaux), (schéma 3): selon le type de séparation voulu 1- Godets passent en position horizontale lors de l’accélération - Godets disposés sur crochet ou système à bascule - Doit être dans une enceinte en cas d’accident - Utiliser principalement dans les centrifugation en gradients 2- Tubes placés dans des logements creux incliné entre 15 et 40 degrés - Utiliser principalement pour les centrifugations différentielles 3- Très peu utiliser Schéma 3

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Utilisations La centrifugation différentielle est une technique employée dans les domaines de la biochimie et de la biologie cellulaire et permettant de séparer les organites et autres particules sub-cellulaires de la cellule selon leurs vitesses de sédimentation. Le culot formé par chaque un constituant donné peut ensuite être isolé et analysé au besoin. Cette technique reste la plus couramment utilisée lorsqu’il s’agit de séparer des organites d’un tissu cellulaire hétérogène en raison de sa nature simple et rapide. Pour donner un exemple concret, dans le cas de l’étude d’un virus, on peut utiliser la centrifugation différentielle afin de pouvoir comparer les organites d’individus sains et malades de groupes d’âge différents dans le but d’observer l’influence du virus sur celles-ci. Si on voulait chercher à comparer des mitochondries, il s’agirait tout simplement de prélever le tissu cellulaire de ces individus, de l’homogénéiser, puis de lui faire subir deux cycles. Au bout du deuxième cycle, les mitochondries sédimentent et forment un culot au fond du tube. On obtiendrait donc un échantillon de mitochondries prêt à être observé. Un autre exemple pouvant illustrer l’utilité de cette technique est l’étude des vésicules extracellulaires (EV), notamment les exosomes. En effet, on sait que les cellules sécrètent un nombre de vésicules membranaires qui se différencient selon les mécanismes de leur formation, leur contenu moléculaire et leur taille. La centrifugation différentielle est la méthode la plus souvent choisie pour séparer et étudier ces EV. L’étude des exosomes suscite beaucoup d’intérêt dans le cadre de la recherche médicale : étant porteurs de marqueurs moléculaires de nombreuses maladies, ils pourraient servir d’outil de diagnostic.

Limites et Avantages

• Limites : - Lors de la phase d’homogénéisation avant la centrifugation, les constituants résultants peuvent être plus ou moins endommagés

- L’intensité énergétique des dispositifs est élevée - Pour les organites de petites tailles, il faut centrifuger longtemps et à des grandes vitesses • Avantages : -

La centrifugation permet d'obtenir un sédiment avec un taux d'humidité faible Elle permet la séparation des suspensions finement dispersées Si on veut des organites massives, pas besoin de centrifuger longtemps Facile d’utilisation

Sources

• http://coproweb.free.fr/gbearemi/pf4pm1.htm • https://planet-vie.ens.fr/thematiques/manipulations-en-laboratoire/la-centrifugation • http://www8.umoncton.ca/umcm-gauthier_didier/siitub/centgradient.html 3

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http://fr.nextews.com/6a761d63/ https://fr.questionofwill.com/8841-centrifugation-what-it-is-types-importance-examples http://uriell.free.fr/rapport-stage/SV1-Separation-des-molecules.pdf https://fr.wikipedia.org/wiki/Centrifugation http://tpeforcecentrifuge.e-monsite.com/pages/q.html https://www.coleparmer.com/tech-article/centrifugation-basics?tlg=frFR#:~:text=par%20force%20centrifuge.-,

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1.,sub%2Dcellulaires%20et%20de%20macromolécules https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4607254/#!po=10.9467 https://www.medicinus.net/methodes_etude_cellule/amp/ https://www.slideshare.net/gautamparmar18/cell-separation-by-centrifugation https://www.slideshare.net/pankajnaliyapara/centrifuge-33701880 https://www.slideshare.net/suraiyaoyshe/centrifugation-54534649 https://www.slideshare.net/ibtihalosman/centrifuge-51848995 https://www.slideshare.net/rakshmitharakshmitha/differential-centrifugation https://www.slideshare.net/laxmisaisurapaneni/centrifugation-38278930

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