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Citrometría de flujo. Fundamentos y aplicaciones.

2º Inmunología

Citometría de flujo. Fundamentos y aplicaciones 1. Introducción La base del citómetro es el laser que emite radiación a una determinada longitud de onda. La muestra se hace pasar por un capilar a una alta presión, lo que hace que las células se dispongan en fila. El láser excita la muestra que pasa por el capilar. Detección de la fluorescencia de los fluorocromos. Tienen que tener una longitud de onda de la emisión de la excitación determinada. Propiedades y Ventajas de la Medida de fluorescencia en células individuales por citometría de flujo -

Mide en cantidades elevadas de células Obtener conclusiones estadísticamente fidedignas objetivas y reproducibles Alta velocidad Altísima sensibilidad - 1974(3000mol/cel) 2003 (300mol/cel) Es cuantitativa con un amplio rango de medida Permite estudio multiparamétrico simultáneo Es específica de color

Marcaje de antígenos por inmunofluorescencia En el marcaje directo el anticuerpo monoclonal que tiene el fluorocromo en la región constante se une a la célula de forma específica. En el marcaje indirecto el anticuerpo monoclonal que tiene el fluorocromo en la región constante se une al anticuerpo monoclonal unido a la célula específicamente de forma inespecífica. -

Marcaje de Superficie: directo o indirecto Marcaje Intracelular: directo o indirecto

MARCAJE de SUPERFICIE (DIRECTO) Detectan cuantitativa y cualitativamente. Existen multitud de variantes en función del ensayo, con multitud de fenotipos posibles. MARCAJE INTRACELULAR (DIRECTO) 1. 2. 3. 4.

Marcaje superficial. Fijación. Permeabilidad. Marcaje intracelular. 1

2. Inmunofenotipado por citometría de flujo Teoría de la citometría de flujo La práctica realizada el primer día consiste en un inmunofenotipado por citometría de flujo. En primer lugar es importante tener algunos conceptos claros para poder llevar a cabo la práctica: -

Anticuerpo monoclonal: Maduración somática: Fluorocromo: Marcadores CD:

Una citometría de flujo es una técnica que puede detectar diferencias de tamaño, complejidad interna (granularidad relativa) y también fluorescencia, asociada a cada partícula que contiene nuestra muestra. Es decir, es capaz de separar las células en función a estas tres características.

Si nuestra muestra es de sangre, como es el caso de esta práctica, podemos encontrar, tras el análisis de la muestra por el citómetro, una gráfica en la cual aparecen granulocitos (una mancha de mayor tamaño), monocitos y linfocitos (de tamaños más pequeños). De las tres características nombradas en un inicio, es el tamaño la que se usa como umbral para separar las células. La muestra será absorbida por un capilar que está inmerso en una cámara de fluido continuo de PBS, el cual ejercerá una presión determinada. No habrá unión de PBS y muestra debido a la gran presión ejercida, la cual hace que las partículas sean arrastradas por el capilar hacia arriba de modo que éstas pasan de una a una por un rayo de luz incidente.

El rayo de luz a una determinada longitud de onda atraviesa la partícula, y ésta, dependiendo de su tamaño y su complejidad interna (granularidad), dispersará en mayor o menor medida la luz. Las de mayor tamaño y complejidad dispersarán en un ángulo mayor la luz que las más pequeñas o simples. También la luz es capaz de excitar, si nuestra muestra lo lleva, un fluorocromo y que tengamos señales de distintos colores para detectar distintas partículas o tipos de células. La dispersión de luz es detectado y se registra en un ordenador que nos muestra gráficos fácilmente interpretables y donde distinguimos las distintas partículas según su tamaño y granularidad, y también según el marcador que exprese en mayor o menor medida. Realización de la práctica e interpretación de los resultados Utilizando la técnica anteriormente explicada, la de citometría de flujo, se va a llevar a cabo la realización de un inmunofenotipado, es decir, realizamos la detección de subpoblaciones linfocitarias en una muestra de sangre periférica. Para ello se trabaja del siguiente modo:

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Material usado: -

Cuatro tubos de citometría de flujo

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Tubos con anticuerpos monoclonales para cada tipo de molécula (marcador CD) y con distintos fluorocromos Muestra de sangre periférica.

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1) Preparación de la muestra en los tubos de citómetro de flujo El tubo 0: nos servirá como control. En él cargamos 5 μl sólo de CD45 (marcador leucocitario, que expresan todos los leucocitos) El tubo 1: Cargamos 5 μl de CD3 (lo presentan todos los linfocitos T) y 5 μl de CD4 (lo presentan los linfocitos T helper (TH). En este tubo detectaremos fácilmente los linfocitos TH. El tubo 2: Cargamos 5 μl de CD3 (lo presentan todos los linfocitos T) y 5 μl de CD8 (lo presentan los linfocitos T citotóxicos). En este tubo detectaremos fácilmente los linfocitos T citotóxicos.

El tubo 3: Cargamos 5 μl de CD19 (marcador de los linfocitos B) y CD56 (marcador de células Natural Killer). En este tubo, por tanto, detectaremos tanto linfocitos B como NK. Cada uno de los marcadores debe tener un color diferente. 2) Incubación de las muestras Tras esto, a cada tubo se le añaden 50 μl de sangre periférica con anticoagulante. Se agita en el vórtex y se incuba durante 15 minutos en oscuridad. Esto se hace para que no se exciten los fluorocromos antes de tiempo. 3) Adicción de la solución lisante e incubación Cuando han pasado 15 minutos mínimo de incubación, se deben añadir a cada tubo 1 ml de solución lisante. Esto sirve para lisar los hematíes y plaquetas, que tienen una membrana más débil, sin que se lisen o rompan el resto de células. De este modo conseguimos que el citómetro no se sature posteriormente. Por último se vuelve a incubar durante 15 minutos. 4) Centrifugación a 1000 rpm Se centrifugan los cuatro tubos tras la segunda incubación para eliminar los restos celulares que quedan en el sobrenadante, quedándonos con el precipitado, que son las células que nos interesan. Después se lavan y se resuspenden con tampón. 5) Uso del citómetro Una vez tenemos las muestras preparadas, encendemos y purgamos el citómetro (eliminamos las burbujas de aire) y finalmente dejamos que éste analice nuestras muestras. Tal y como se predijo en la preparación de muestras, las gráficas obtenidas nos permiten detectan en el tubo 1 los linfocitos TH, en el tubo 2 los linfocitos T citotóxicos y en el tubo 3 los linfocitos B y natural killer. 3

3. Aplicaciones de la citometría de flujos a) El síndrome de Bruton. Agammaglobulinemia ligada al sexo XLA Es una inmunodeficiencia primaria. Se debe a un defecto en la diferenciación de las células B, y hay una disminución o una ausencia total de anticuerpos. En clínica: se observa por una disminución de todos los isotipos de inmunoglobulinas, una ausencia o gran disminución del número de linfocitos B, infecciones bacterianas (piógenas) graves recurrentes (neumonías), respuesta humoral frente a vacunas muy reducidas. El inicio de los síntomas se produce habitualmente en el primer año de vida. Es una herencia ligada al cromosoma X. Esta enfermedad se detecta por el análisis de la expresión de Bfk en monocitos mediante citometría de flujo b) La citometría de flujo en el estudio de la fagocitosis La función de ingestión y destrucción de los microorganismos está mediada por los fagocitos: los NEUTRÓFILOS en las primeras fases de la respuesta inmunitaria innata, y los MACRÓFAGOS en las fases tardías de la misma. -

Captación de las partículas marcadas por fluorescencia. Determinación del estado de las partículas intracelulares y extracelulares.

El ensayo consiste en: -

Los fagotitos marcados con sonda fluorescente, como por ejemplo, fluoresceína. Los fagotitos se mezclan con los fagocitos para que tenga lugar la fagocitosis.

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Un absorbente fluorescente se añade para remover la fluorescencia de las partículas unidas a la membrana, las cuales no son fagocitadas pero permanecen en la superficie.

La fluorescencia remanente representa a las partículas internas. ENFERMEDAD GRANULOMATOSA CRÓNICA (EGC) -

Es el desorden fagocítico más común, tiene una frecuencia de 1/125.000 nacimientos.

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La EGC esta genéticamente determinada y se caracteriza por la incapacidad de las células fagocíticas de destruir bacterias catalasa positivas

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Es causada por un defecto en la vía oxidativa por medio de la cual los fagocitos liberan superóxido, NADPH oxidasa, peróxido de hidrógeno, Superóxido dismutasa, y ácido hipocloroso, Mieloperoxidasa. La EGC se origina a partir de las mutaciones en cualquiera de estos genes.

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Un defecto en el gen que codifica para gp91-hox CYBB (ubicado en el cromosoma X, Xp21-1) produce la variedad ligada a X (presente en el 65% de los pacientes).

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Defectos en los otros componentes, p47-phox, p67-phox, p40-phox, p22-phox, son de herencia AR.

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c)

Test de activación de basófilos (TAB) en el diagnóstico in vitro (ex vivo) de enfermedades alérgicas

Activación de basófilos y mastocitos por sIgE BASÓFILO INACTIVO



BASÓFILO ACTIVADO

En el test de activación de basófilos (TAB), la citometría de flujo se emplea con dos objetivos: • Discriminar los basófilos de las restantes poblaciones leucocitarias • Detectar la expresión “de novo” o el incremento de expresión de CD63 o CD203c, respectivamente Los basófilos de la muestra se identificaban mediante la expresión de sIgE. Estimulando los basófilos con fMLP (CP) la expresión de CD63 aumenta. En ciertos pacientes no se podían identificar basófilos al no reaccionar frente a la anti-IgE. En estos casos se utilizó la expresión de CD123 (IL3R, marcador de basófilos y de células dendríticas), así como la de HLA-DR (que no se expresa en basófilos), para identificar los basófilos de la muestra. d) Detección de citoquinas intracelulares Las células de la inmunidad específica e inespecífica se conectan entre sí para regular la respuesta defensiva mediante dos mecanismos: • Contacto directo intercelular a través de moléculas de superficie • Síntesis de citoquinas. Las células de la inmunidad específica e inespecífica se conectan entre sí para regular la respuesta defensiva mediante dos mecanismos: • Contacto directo intercelular a través de moléculas de superficie • Síntesis de citoquinas

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Dificultades en el análisis de citoquinas El estudio de las citokinas es complicado debido a algunas de sus características biológicas: • • • • •

Son moléculas de vida media corta No se almacenan como moléculas preformadas Síntesis y liberación de forma breve y autolimitada Su activación puede requerir modificación posttraduccional Muchas citokinas son sintetizadas por tipos celulares distintos

Estimulación de la síntesis de citoquinas • Las células no activadas producen niveles indetectables de citoquinas. • La activación de las células de interés se puede inducir por diferentes tipos de estímulos policlonales o específicos: Activación mitogénica, activación policlonal, quimiotáctica, entrecruzamiento de receptores, con superantígenos o con antígenos específicos. Detección de citoquinas (permeabilización celular y marcaje) Inhibición del transporte de proteínas: acumulación en AG o RE. • Las citoquinas son secretadas rápidamente al exterior de la célula • En ausencia de inhibidores del transporte de proteínas, los niveles intracelulares de citoquinas se reducen notablemente

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