Cycle de Krebs PDF

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description et explication du cycle de krebs et des coenzymes...

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BCH 301

E. Devarenne-Charpentier

CYCLE DE KREBS I. Introduction Le rôle principal du cycle de Krebs est l’oxydation de l’acétylCoA en 2 molécules de CO2. On parle de: - Cycle de Krebs - ou Cycle de l’acide citrique / citrate - ou Cycle des acides tricarboxyliques Ce cycle, dans le catabolisme oxydatif, joue un rôle essentiel: • Etape finale du catabolisme des glucides, des lipides et des protéines • Formation de coenzymes d’oxydoréduction réduit: NADH + H+ et FADH2 • Synthèse de métabolites intermédiaires qui seront le précurseur d’autres molécules biologiques À ce stade, la reoxydation des coenzymes permet la production de plus de 90% de l’ATP. C’est une voie métabolique cyclique composée de 8 réactions enzymatiques se déroulant dans la matrice mitochondriale. Il y a donc une molécule «!porteuse! » fixatrice de l’AcétylCoA qui va être resynthétiser à al fin du cycle. Il s’agit de l’oxaloacétate. O

O—C—COOH

H3C—C—SCoA

H2C—COOH

Acétyle CoA

Oxaloacétate

C’est une voie existante dans toutes les cellules excepté les globules rouges. Sur les 8 réactions, 4 sont des réactions d’oxydoréduction s’accompagnant de la formation de coenzymes réduits. Une seule réaction produit un nucléotide triphosphate étant le GTP. Comment ce cycle a-t-il été mis en évidence ? Les premiers travaux datent des années 1930. La première observation fut que l’addition de succinate, de fumarate et de malate à un broyât de cellules musculaires se traduit par une augmentation de la consommation de l’oxygène par le broyât. Ce sont donc 3 intermédiaires du cycle de Krebs catabolisés par la cellule musculaire. En 1936 a été mis en évidence l’importance du citrate dans la respiration cellulaire. Dans ces travaux, il a été mis en évidence que le citrate est un métabolite intermédiaire qui est transformé en α-cétoglutarate. En 1937, Krebs et Johnson montrent que le citrate est le produit de la combinaison du pyruvate avec l’oxaloacétate. Suite à cela, Krebs reçoit un Prix Nobel de Biochimie en 1958. II. Réactions 1e Réaction Elle permet la synthèse de citrate par la citrate synthase qui la catalyse à partir d’oxaloactétate et d’acétylCoA. C’est une réaction de condensation. CONDENSATION

O—C—COOH H2C—COOH

Oxaloacétate

HYDROLYSE

H2C—C~SCoA

H2O

CoASH

H2C—COOH

HO—C—COOH

HO—C—COOH

H2C—COOH

H2C—COOH

CitrylCoA

Acide citrique ~ Liaison thioester

C’est de l’oxaloacétate endogène càd déjà présent dans la matrice. La concentration en oxaloacétate dans la matrice est donc le facteur limitant du cycle de Krebs. Sinon, il y a accumulation d’acétylCoA. L’hydrolyse de la liaison thioester est une réaction est exergonique de ΔG’0= - 31,38 KJ.mol-1. Page 1  sur 6 

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2e Réaction Elle catalyse l’isomérisation du citrate en isocitrate grâce à la cis-aconitase. Elle se fait en deux étapes: • Déshydratation: Elimination d’une molécule d’eau • Hydratation: Ajout d’une molécule d’eau H2C—COOH

H2C—COOH

H2O

H2C—COOH

H2O

HO—C—COOH

C—COOH

HC—COOH

H2C—COOH

H—C—COOH

HO—C—COOH

Cis-aconitate

Isocitrate

Citrate

Ce sont des réactions réversibles avec un

ΔG’0=

+ 6,7

KJ.mol-1

Elle est dite stéréospécifique. Le citrate est une molécule symétrique contrairement à l’isocitrate. En effet, l’enzyme catalyse le transfert de l’hydrolyse sur le carbone qui provient de l’oxaloacétate. Elle ne transfert jamais sur celui provenant de l’AcétylCoA. On a deux réactions équilibrées. Malgré tout, c’est le citrate qui est largement majoritaire (90%), la forme isocitrate correspond à 6-7%. C’est la consommation de citrate qui induit l’équilibre vers la formation de l’isocitrate. Ces acides sont tricarboxyliques. 3e Réaction Elle fait intervenir l’isocitrate déshydrogénase qui catalyse la décarboxylation oxydative de l’isocitrate. C’est la première réaction d’oxydoréduction qui se fait également en deux étapes. H2C—COOH

NAD+

NADH + H+

H2C—COOH

HC—COOH

HC—COOH

HO—C—COOH

O—C—COOH

Isocitrate

H2C—COOH

CO2

CH2 O—C—COOH

Oxalosuccinate

Acide α-cétoglutarique

NB: On met l’intermédiaire entre crochets pour montrer qu’il est très instable et très rapidement décarboxylé. C’est une réaction est exergonique et irréversible de ΔG’0= - 29 KJ.mol-1 L’α-cétoglutarate est un α-cétoacide. il joue un rôle important dans les réactions de transamination ayant lieu au cours du métabolisme azoté. O R—C—COOH

α-cétoacide:

α

L’enzyme isocitrate déshydrogénase a une régulation est de type allostérique. Elle peut exister sous différente conformations, active et inactive. Le passage de l’une à l’autre dépend de la nature du ligand. On parle d’effecteur allostérique positif tel que l’ADP et le NAD+ ou négatif tel que l’ATP et le NADH. Effecteur ⊕ Effecteur ⊖

Ainsi, pour passer de la conformation inactive à active, il faut un effecteur allostérique positif et inversement. 4e Réaction Elle fait intervenir l’α-cétoglutarate déshydrogénase qui catalyse une seconde réaction de décarboxylation oxydative d’α-cétoglutarate en succinylcoenzymeA. H2C—COOH CH2

H2C—COOH + NAD+ + CoASH

ΔG’0= - 30 KJ.mol-1

O—C—COOH

CH2

+ CO2 + NADH + H+

O—C—CSCoA SuccinylCoA

α-cétoglutarate

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L’α-cétoglutarate déshydrogénase est un complexe multi-enzymatique dont le fonctionnement est similaire à la PDH. Ce complexe requiert la présence de 5 coenzymes pour être actif dont 2 sont libres. Ce sont ceux qui apparaissent dans le bilan de la réaction. - Libres: NAD+, CoASH - Liés: Lipoamide, TPP, FAD 5e Réaction Il s’agit de la synthèse de succinate par la succinate thiokinase aussi appelée succinylCoA synthase qui catalyse la conversion du succinylCoA en succinate avec l’intervention de GDP. En effet, l’enzyme est spécifique du GDP. L’énergie issue de la liaison thioester du succinylCoA est utilisée pour la synthèse de GTP. H2C—COOH CH2

ΔG’0= - 3,3

H2C—COOH

+ GDP + Pi

H2C—COOH

O—C—CSCoA

+ GTP + CoASH

Succinate

SuccinylCoA

Cette réaction est importante car on obtient du succinate qui est une molécule symétrique. On ne peut plus faire de distinction des carbones de l’AcétylCoA et de l’oxaloacétate. On parle d’étape de randomisation. 6e Réaction Elle fait intervenir la succinate déshydrogénase qui convertit le succinate en fumarate. Elle est inhibée par l’oxaloacétate et par le malonate. D’un point de vue réactionnel, on a une réaction dite de trans-élimination puisque le fumarate est toujours en conformation trans ou E. C’est donc une réaction stéréospécifique. H2C—COOH H2C—COOH

H

ΔG’0= + 0,4

+ FAD

COOH

+ FADH2

COOH H Fumarate

Succinate

Chez les mammifères, la succinate déshydrogénase est localisée à la membrane interne de la mitochondrie. Elle est directement liée à la chaine des transporteurs des électrons. C’est la seule exception. Toutes les autres enzymes sont localisées dans la matrice mitochondriale. Chez les procaryotes, elle est localisée à la face interne de la membrane plasmique. 7e Réaction Elle fait intervenir la fumarase qui convertit le fumarate en L-malate dans une réaction de trans-addition au niveau de la double liaison. Il y a addition d’une molécule d’eau de part et d’autre de la liaison. H COOH

COOH H

ΔG’0= - 3,8

+ H2O

HO—CH—COOH H2C—COOH

Fumarate

L-malate

8e Réaction Elle est catalysée par la malate déshydrogénase qui convertit le L-malate en oxaloacétate. Elle requiert la présence d’une molécule de NAD+ . HO—CH—COOH H2C—COOH

+ NAD+

ΔG’0= + 30

O—C—COOH H2C—COOH

L-malate

Oxaloacétate

Ceci explique que dans la matrice mitochondriale, la concentration en oxaloacétate est très faible puisqu’elle est de l’ordre de 0,03 μM. Page 3  sur 6 

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III. Bilans ➣Equation bilan d’une molécule d’AcétylCoA en 2 molécules de CO2 grâce au cycle de Krebs: 1. AcétylCoA + Oxaloacétate + H2O ⟶ Citrate + CoASH 2. Citrate ⟶ Isocitrate 3. Isocitrate + NAD+ ⟶ CO2 + α-cétoglutarate + NADH + H+ 4. α-cétoglutarate + NAD+ + CoASH ⟶ CO2 + SuccinylCoA + NADH + H+ 5. SuccinylCoA + GDP + Pi ⟶ Succinate + GTP + CoASH 6. Succinate + FAD ⟶ Fumarate + FADH2 7. Fumarate + H2O ⟶ L-malate 8. L-malate + NAD+ ⟶ Oxaloacétate + NADH + H+ AcétylCoA + 3NAD+ + 1FAD + GDP + Pi + 2H2O ⟶ 2CO2 + 3(NADH + H+) + 1FADH2 + GTP + CoASH Bien que l’on parle de l’oxydation d’une molécule d’AcétylCoA en 2 molécules de CO2, ce n’est pas les carbones issus de l’AcétylCoA qui sont utilisés pour le CO2 mais ceux de l’oxaloacétate. Il faudra au moins 2 tours de cycle pour les retrouvés au niveau de l’AcétylCoA par radioactivité. Bilan énergétique: 3(NADH + H+) → 3x3 ATP 1 FADH2 → 1x2 ATP 1 GTP → 1 ATP ➣12 ATP/ AcétylCoA Bilan énergétique de l’oxydation complète d’une molécule de glucose en condition oxydative. On doit obtenir 6 molécules de CO2 : Glycolyse

Glucose (6C)

Décarboxylation du pyruvate

2 pyruvate (2x3C)

2 CO2 + 2AcétylCoA (2x2C)

Cycle de Krebs

2x2CO2

Voie métabolique

Coenzyme réduits

ATP formés

1. Glucose → 2 pyruvate

2(NADH + H+)

(2 x 3) + 2 (du ADP + Pi)

2. Pyruvate → 2AcétylCoA

2(NADH + H+)

2x3

3. 2AcétylCoA → 2x2CO2

2 x 3 (NADH + H+) (2 x 1 FADH2) + (2 x 1 GTP)

2(AcétylCoA) x 3 (NAD) x 3 (ATP) (2 x 1 x 2) + (2 x 1) 38 ATP / glucose

IV. Rôles du cycle • Oxydation de l’AcétylCoA en 2CO2: Voie terminale du catabolisme oxydatif • Formation de coenzymes réduits: NADH + H+ et FADH2 • Synthèse de précurseurs métaboliques: A partir desquels peuvent être synthétisées d’autres molécules: - α-cétoacide: α-cétoglutarate, oxaloacétate (peuvent être transaminés en glutamate, aspartate) - Citrate: Rôle dans la biosynthèse des acides gras - Malate: Peut être le précurseur métabolique du glucose V. Régulation du cycle (paramètres) ✧ Concentration en oxaloacétate Dans la matrice mitochondriale, elle est de l’ordre de 0,003 μM. Ainsi, toute modification donne lieu a des perturbations sur le cycle. Deux enzymes palient à cette baisse:

- Pyruvate carboxylase (matrice mitochondriale): Catalyse de la carboxylation du pyruvate Attention: 2 enzymes de même substrat: PDH et PC dont l’une inhibe l’autre lorsqu’elle est active C’est la plus importante et majoritaire et a principalement lieu dans les cellules du foie et des reins Pyruvate + CO2 + ATP ⟶ Oxaloacétate + ADP + Pi Page 4  sur 6 

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- PEPcarboxykinase(cytosolique): Catalyse la formation du PEP en oxaloacétate: Réaction mineure qui a lieu dans les muscles et le myocarde. Elle est inhibé par l’aspartate. PEP + CO2 + GDP ⟶ Oxaloacétate + GTP Il existe chez les levures et les plantes, une PEP carboxylase qui catalyse le PEP en oxaloacétate sans qu’il y ait synthèse de GTP. GTP

CO2

PEP

GDP

Oxaloacétate

PEP carboykinase ADP + Pi

Pyruvate kinase

ATP CO2

t va

a ec

r

ru Py NADPH+H+

x bo

yla

se

NAPH+H+

Malate déshydrogénase

NAD+ NADP+

Pyruvate Enzyme malique

Malate

✧ Disponibilité en substrat: Pyruvate et AcétylCoA ✧ Régulation allostérique de certaines enzymes lorsque la concentration est élevée en: • NADH+H+: Inhibition de l’isocitrate déshydrogénase et l’α-cétoglutarate déshydrogénase • Citrate: Inhibe la citrate synthase • SuccinylCoA: Peut être un effectue allostérique négatif de l’α-cétoglutarate déshydrogénase ✧ Régulation en amont de la PDH: Rejoint la disponibilité en substrat VI. Cycle du glyoxylate On parle aussi de shint glyoxylique. C’est une variante du cycle de Krebs mais très importante qui n’existe que chez les végétaux (principalement en cours de germination) et les micro-organismes. Il permet la synthèse de dérivés à 4C que sont le malate et l’oxaloacétate à partir d’AcétylCoA provenant essentiellement des lipides localisés de la graine en germination. 1e Réaction Elle implique une isocitrate lyase qui clive l’isocitrate en glyoxylate et succinate. Ce dernier rejoint le cycle de Krebs. CH2—COOH H2C—COOH

CH—COOH

H2C—COOH

+

CHO

COOH

HO—CH—COOH Isocitrate

Succinate

Glyoxylate

2e Réaction Elle implique la malate synthase qui catalyse la synthèse de malate à partir du glyoxylate et d’une autre molécule d’AcétylCoA.

CHO COOH

Glyoxylate

O

+

H3C—C—SCoA

AcétylCoA

HO—CH—COOH

+ CoASH

H2C—COOH

L-malate

Les cycles du glyoxylate et de Krebs fonctionnent en simultané pendant la germination. L’association de ces deux voies permet la synthèse de glucose sans photosynthèse. Page 5  sur 6 

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Cycle de Krebs

Cycle du glyoxylate

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