DNA Fingerprinting mappa concettuale schematizzata PDF

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Mappa del DNA FINGERPRINTING scuola superiore...

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DNA FINGERPRINTING

Ognuno di noi ha un DNA diverso da quello degli altri, possiamo quindi dire che il DNA ha un’impronta-> fingerprint.

Per vedere quest’impronta in laboratorio viene adoperata la TECNICA DEL DNA FINGERPRINTING.

Il DNA di due individui è unico Analizza le sequenze di DNA che rendono unica una persona rispetto ad un’altra.

per il 99,5% 

E’ lo 0,5% di variabilità a renderci unici. Questa è contenuta

COME COSTRUIRE LA PROPRIA IMPRONTA GENETICA:

nelle sequenze microsatellite

1. Estrazione del DNA. 2. Isolare le sequenze microsatellite e moltiplicarle mediante l’uso della reazione a catena della

le quali sono usate per costruire l’impronta

polimerasi (PCR) 3. Grazie all’ elettroforesi sul gel di agarosio sarà possibile vedere l’impronta ad occhio nudo.

genetica.

Viene inserito in una provetta di 1,5 ml che contiene già 500 microlitri di una soluzione che, rompendo le cellule, libera il DNA. Il DNA può essere estratto dalla nostra saliva mediante il passaggio di un bastoncino idrofilo all’interno delle nostre guance e sulle nostre gengive.

La provetta deve essere tenuta a 50°C in un termostato per 5 minuti, poi viene centrifugata per 10 minuti così da lasciare il DNA in soluzione.

Ad interessarci ora è il DNA

Si notano così 2 strati: quello superiore

precipitato (pellet).

contiene il DNA (surnatante) e bisogna

Bisogna eliminare il liquido e

prelevarne 400 microlitri.

compiere una sospensione del pellet

Bisogna poi aggiungere 20 microlitri di

in 200 microlitri di etanolo al 70%,

cloruro di sodio (NaCl) al 5% ->

in questo modo vengono eliminate le

neutralizzare le cariche negative del DNA, e

impurità. Dopo averlo centrifugato

400 microlitri di etanolo assoluto.

per altri 5 minuti, si deve eliminare il surnatante e far asciugare bene il pellet.

Si deve mescolare bene invertendo la provetta e centrifugare per 5 minuti.

Lasciare la provetta aperta nel termostato a 60°C per 10 minuti, in questo modo si fa evaporare l’alcool per far sciogliere il DNA. Quando il pellet è completamente secco, lo risospendiamo in 50 microlitri di tampone -> questa soluzione contiene RNasi (enzimi che degradano l’RNA e rendono il DNA recuperato più puro).

Il DNA estratto è il DNA GENOMICO

Mettiamo il tampone a 37°C per 10 minuti così che gli enzimi abbiano il tempo di agire.



L’intera sequenza del materiale genetico è contenuto nelle cellule della bocca ma, per analizzare l’impronta, ci servono solo tantissime copie dei microsatelliti.



Dobbiamo moltiplicare il DNA di partenza copiando tante volte solo le sequenze che ci interessano -> dobbiamo fare la PCR.



Ci deve essere una soluzione che contiene 3 coppie di inneschi (i primer), i nucleotidi, i batteri di reazione con sali di magnesio, l’enzima tacpolimerasi che amplifica il DNA e l’acqua sterile.

La miscela deve essere conservata in ghiaccio. Bisogna poi contrassegnare le provette:  

“1” -> DNA estratto “SC” -> DNA proveniente da una macchia di sangue trovata



sulla scena del crimine. “A” “B” “C” -> DNA proveniente da 3 sospettati diversi



“0” -> miscela PCR, ci serve per verificare che non ci siano contaminazioni. (Ogni provetta ne contiene 10 microlitri)

Aggiungiamo due microlitri di DNA nelle varie provette:

Le provette vanno trasferite nel termociclatore dove il DNA viene amplificato grazie a variazioni di temperatura. Queste sono organizzate in 3 fasi: o o o

Denaturazione Anneling Allungamento

Quando la temperatura si

La temperatura raggiunge in 95°C i due filamenti di DNA che si separano.

I quattro filamenti si separano.

abbassa, gli inneschi si legano ad una specifica sequenza di DNA, la regione che si vuole amplificare.

La temperatura aumenta, la DNA polimerasi batterica riconosce l’innesco ed inizia la sintesi del filamento di DNA complementare allo stampo. Dato che i filamenti sono antiparalleli, le polimerasi procedono in direzione

Legame primer.

opposta. polimerasi.

Estensione ad opera delle DNA

Con il terzo ciclo, ogni nuovo filamento di DNA diventa, a sua volta, stampo.  Si ottengono le prime copie della sequenza desiderata.

Nei cicli successivi il numero delle copie di DNA aumenta. Dopo circa quattro ore la PCR è conclusa e la macchina conserva il campione a 4°C così da mantenerlo fino al momento dell’analisi.

Per vedere il risultato della PCR, ci serviamo dell’ELETTROFORESI SU GEL di agarosio che ci permette di distinguere i frammenti di DNA a seconda del loro peso molecolare: quelli più piccoli migrano più velocemente degli altri.



La sua polvere viene sciolta nell’apposita soluzione tampone, poi si mette nel forno. Aggiungere acqua distillata per compensare l’evaporazione avvenuta nel forno (così ci



assicuriamo che la concentrazione del gel resti a 2%). Aggiungiamo un colorante che si legherà al DNA, ciò ci consente di vedere le bande sotto la luce ultravioletta.

 

Versiamo il liquido nello stampo e lo facciamo raffreddare finché non diventa compatto. Aggiungiamo alle provette di PCR due microlitri di soluzione colorante che ci serve per capire se la corsa elettroforetica procede bene.



Centrifughiamo le provette per far sì che il colorante si mescoli bene al DNA.



Carichiamo i tamponi sul gel di agarosio.

 Nel primo pozzetto carichiamo 10 microlitri di un marcatore che ci aiuterà a determinare il peso molecolare delle varie bande.  Nel secondo mettiamo il DNA di partenza.  Nel terzo mettiamo o il DNA estratto dalla scena del crimine.  Nel quarto, quinto e sesto mettiamo il DNA dei sospettati.

 Nell’ultimo mettiamo il controllo negativo.

La corsa elettroforetica è pronta per “partire”. Chiudiamo il coperchio e colleghiamo i morsetti della camera di corsa ai poli del generatore di corrente. Per separare i frammenti, il gel viene messo in un campo elettrico  voltaggi al valore di 80 V.

Finita la corsa elettroforetica, recuperiamo il gel e lo poniamo sul transilluminatore. La luce ultravioletta ci consente di distinguere le bande che si sono formate per ogni campione.

Aumentiamo a 100 V per 40 minuti quando il DNA esce dai pozzetti ed entra nel gel....