분자생물학 DNA polymerase & structure PDF

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6: DNA Polymerases: Structure and Function 윤영익 DNA polymerases make a complementary copy of one DNA strand -DNA template strand 에 움직이면서, complementary base pairing 을 통해 새로운 stand 를 만듦 -3’OH 끝에 붙음 -accuracy = fidelity 정확도  DNA Polymerase 의 역할 -error 가 있을 경우, exonuclease 활동이 일어나 잘못된 sequence 를 분해하고 맞...

Description

6.2: DNA Polymerases: Structure and Function 윤영익 DNA polymerases make a complementary copy of one DNA strand -DNA template strand 에 움직이면서, complementary base pairing 을 통해 새로운 stand 를 만 듦 -3’OH 끝에 붙음 -accuracy = fidelity 정확도  DNA Polymerase 의 역할 -error 가 있을 경우, exonuclease 활동이 일어나 잘못된 sequence 를 분해하고 맞는 nucleotide 를 넣음. DNA polymerases carry out a number of different functions in the cell -다양한 function: replication, repair, damaged DNA 에 대한 replication 을 다시하는 polymerase -single protein / multiple subunits Replicative Polymerase -Bacteria: DNA polymerase III (1000nucleotides/sec) -Eukaryote: lagging strand- delta polymerase (pol δ), leading strand- epsilon polymerase (pol ε) (50nucelotides /sec) -subunit 다양한 function: 예) proofreading, replication, DNA template 에 붙을 수 있도록 -Processivity: ability to remain attached to the template The structure of a DNA polymerase resembles a right hand -Polymerase complex 중 가장 보존된 subunit 은 nucleotide 를 붙이는 catalytic site (DNA polymerase I: RNA primer 없애면서 replication 끝낼 때 필요한 enzyme) -오른손처럼 생김 (3 domain: palm, fingers, thumb) -Palm: catalytic site 이자 mostly conserved region of DNA polymerase (dsDNA 가 grow 하는 곳) Elongation: Nucleoside Triphosphate (NTPs)가 growing daughter strand 에 붙음 -Finger: 들어오는 NTP 를 position 하는 역할 -Thumb: DNA 가 elongate 할 수 있도록 hold 하는 역할 (processivity) -pol I 에는 3’-5’ exonuclease function 을 하는 domain 이 더 있음.

The polymerase active site catalyzes the addition of nucleotides onto the growing DNA chain -Active site: phosphoryl transfer reaction: 5’ phosphoryl group 을 3’ hydroxyl end 에 link 를 해 phosphodiester bond 를 만듬 -Nucleophilic attack: 여기서 중요한 것은 2 개의 Mg2+의 역할 (aspartate 의 carboxylate group 으로부터). 첫번째 Mg2+은 terminal nucleotide 의 3’OH 를 활성화함. 두번째 Mg2+는 새로 들어 오는 NTP 와 interact 해서 negative 한 charge 을 stabilize 함. 그 결과로, 3’OH 와 alpha-

phosphoryl group (새로 들어오는 NTP)이 interact 해 새로운 O-P bond 를 생성함. 2 개의 phosphate group 은 pyrophosphate(PPi)의 형태로 release 함. -finger domain alpha helix 의 R chain 과의 interaction 을 통해 triphosphate 을 stabilize 함. -pyrophosphate 가 분해되면서 reaction 을 forward 하게 가져갈 수 있는 free energy 를 공급함.

6.1 Approach 연구자: Meselson, DNA 가 semi-

Experimental

한 manner 로 로 실험적으로 증명

복제된다는 것으

Matthew Franklin Stahl conservative

1. E.coli 의 DNA 를 N15 heavy isotope 으로 label 함. (Natural isotope 은 N14) 2. Density gradient centrifugation 을 통해 density 가 다른 DNA 를 찾아낼 수 있었음 3. N15 culture bacteria 를 키우다가 N14 containing media 로 넘김. 4. 그 이후 4 번의 cell division 동안 DNA density 를 관찰함. (generation 마다 체크함) 5. 그 ‘time point’마다 DNA 를 isolate 해서 CsCl density gradient 에 centrifuge 함. 예) At 0 generation, N14 media 에 넣기 전에, 모든 DNA 가 ‘heavy’ band 로 나타냄. 1 cell division 후에는, intermediate density 만 존재. 해석: 1 cycle 이후, 모두가 intermediate density 를 보인 것은 old strand 가 heavy 했고 new strand 가 light 했기 때문이라고 봄. 실험이 끝난 뒤, 거의 모든 DNA 가 light:light 였고, 아주 적은 양의 intermediate density 가 검출됨.

Raghuraman: mapped the timing of replication of all replication origins in yeast. (언제 heavy: heavy 에서 heavy:light 로 바뀌는지 시간을 연구)...