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Fitopatología apuntes...

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El diagnóstico y su papel en la fitoprotección

Introducción

Resumen El conocimiento fiable sobre la etiología de cual-

Según Miller y Martin,

citados por Flores et al

quier evento patológico es de singular valor, pues de

(1997), la evolución de las plantas y los organismos

ello dependerá, en gran medida, la eficacia de las

asociados

prácticas de regulación que se diseñen y la sostenibili-

temas desarrollados por el hombre. Las técnicas del

dad económica, social y ambiental de las mismas. Un

monocultivo, el mejoramiento genético de las plantas

sistema de manejo de enfermedades sosteniblemente

y el empleo intensivo de plaguicidas han conducido al

funcional se sustenta en un conjunto de conocimien-

desarrollo de patógenos más nocivos y que resisten a

tos, dentro de los cuales el diagnóstico de casos y la

los plaguicidas. Esta variación genética ha cambiado

evaluación de riesgos de enf ermedades juegan un

las expectativas de los programas de mejoramiento

peso fundamental; por tal motivo el presente trabajo

de plantas y las alternat ivas par a el manejo de las

persigue como propósito ofrecer información sobre

enfermedades.

ellas ha sido alterada por los agroecosis-

las técnicas más comúnmente empleadas en el diag-

Un diagnóstic o opo rtuno que detecte el agente

nóstico de enfermedades de las plantas. En el mismo

causal de un evento patológico es fundamental para el

se detallan la mayoría de las técnicas de diagnóstico

manejo del problema, y ello contribuye a: generar me-

co mú nmen te emp leadas, así c omo aqu ellas más

didas de control efectivas, permite la optimización de

sof isticadas c uyo emp leo p ropor ciona info rmación

los recursos, la reducción de los efectos negativos en

precisa y confiable sobre taxonomía de microorganis-

el medio ambiente y a la vez origina infor mación res-

mos, la fisiología de la enfermedad, la ecología de los

pecto a la interacción patógeno hospedante (Barnes,

patógenos, la amplificación de fragmentos de genes

1994 citado por Flores-Olivas, 1997., Vázquez, 2003).

como rápida alter nativa de la clonación, la modifi-

Al realizar un diagnóstico debe asegurarse de tener

cación de fragmentos de ADN, la detección sensible

un cuadro amplio del caso particular que está anali-

de microorganismos seguido de una segura genoti-

zando y considerar otros factores como, la historia del

pificación,

la transfor mación maligna de tejidos, el

lugar y el patrón de daño causado por la enfermedad

análisis de marcadores genét icos para aplicaciones

o plaga. (MIP Forestales, 2006). Según Rosales 2003,

forenses, pruebas de paternidad y para el mapeo de

citado por Malagón y Pupiro ( 2003 ), el

rasgos hereditarios y el estudio de expresión de genes,

de las enfermedades de forma rápida y precisa evita el

entre otras.

uso desmedido o incorrecto de compuestos químicos

diagnóstico

como plaguicidas.

Palabras clave: Técnicas de inmunodetecció n, técnicas moleculares, diagnóstico de confirmación

Hasta hace unos años la detección de patógenos dependía de métodos que requieren de mucha experiencia, habilidad y conocimiento de la taxonomía

Temas de Ciencia y Tecnología

vol. 12

número

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mayo - agosto 2008

pp

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de los microorganismos.

Además son técnicas que

consumen mucho tiempo, sin embargo las técnicas

1.2 Diagnóstico de confirmación. 1.2.1 Diagnóstico tradicional Se pueden considerar dos fases (Flor es- Olivas,

modernas han permitido una detección más eficiente de variedades patogénicas con mayor rapidez y precisión, ejemplo de ello es el uso de técnicas serológicas

et al, 1997):

•

Diagnóstico macroscópico el cu al se basa en la

(ELISA) y moleculares (PCR) (Rosales, 2003 citado por

obser vación de sínt omas. Es muy importan te la

Malagón y Pupiro, 2003).

experiencia del fitopatólogo y su conocimiento de las variables que inciden en la enfer medad, como

El diagnóstico por PCR resulta más rápido que los

el cultivo a investigar, el suelo, clima, patógeno.

métodos tradicionales y por lo tanto se minimiza las pérdidas de los cultivos por las enfermedades y los

•

Diagnóstico microscópico, que consiste en la ob-

costo s para el trat amiento se reduc en. (Sh aad an d

ser vación de la estructu ras del microo rganismo

Frederick, 2002).

fitopatógeno. Esta obser vación puede ser directamente al microscopio de luz, para el caso de las

A partir de la importancia y el papel que juega en

bacterias, hongos, nemátodos o en el uso de mi-

la fitoprotección un diagnóstico oportuno, se elaboró

croscopía electrónica para identificar a los virus.

el presente trabajo con el objetivo de ofrecer algunas informaciones que pudieran ser útiles para el personal

Para

que se adiestra y/o emplea estos procedimientos en el

mación de estructuras reproductivas, como esporas

el diagnóstico de los hongos se necesita la for -

desempeño de sus actividades profesionales.

o conidios (ver figura 1 y 2) y cuando se trata de las bacterias, el proceso de identificación debe com-

1.Tipos de diagnósticos El diagnóstico incluye la identificación del pro-

plementarse con pruebas bioquímicas (ver figura 3) (Flores- Olivas, et al, 1997).

blema, el alcance del problema, la importancia y la

Comúnmente es necesario aplicar los postulados de

magnitud del problema, el método de control a em-

Koch, para determinar con exactitud la naturaleza del

plear, y la demanda de investigación y costo-beneficio

problema (Flores- Olivas, et al, 1997., Iañez, 1998).

(Vázquez, 2003). En la práctica se realizan dos tipos

Postulados de Koch:

de diagnóstico.

•

1.1 Diagnóstico presuntivo

•

El microorganismo debe estar presente en todos los individuos enfermos.

dante y crecer en cultivo puro.

Para realizar un diagnóstico presuntivo confiable se deben realizar, entre otras, las acciones siguientes: 1.

Examinar el campo y los alrededores.

2.

Identificación de la especie o variedad enferma.

3.

Patrones de anormalidad, distribución geográfica

El microorganismo debe poder aislarse del hospe-

•

La inoculación del microorganismo crecido en cultivo puro debe provocar la aparición de síntomas específicos de la enfermedad en cuestión.

•

El microorganismo debe ser reaislado del hospe-

de la enfermedad en el campo y comparación de

dante infectado de forma experimental.

plantas.

Estos principios de Patología Vegetal sobre los que

Examinar plantas individuales, posición de sínto-

se apoyan gran parte de las investigaciones no pueden

mas y signos.

ser cumplidos por cierto grupo de patógenos como los

Prácticas agrícolas del cultivo: fertilización, riego

virus, ya que su reducido tamaño y su condición de

y control químico.

parásitos endocelulares obligados (no pueden ser cul-

An tes de en viar u na mu estr a p ara diagn osticar

tivados en medios de cultivo artificial). En este tipo de

en fer medades o daño p or insect os al labor at orio,

enfermedades, la obser vación de síntomas en campo

examine la planta para otros problemas como daño

y el empleo de for mas alternativas de inoculación en

por animales, fact ores nutr icionales o ambien tales.

huéspedes diferenciales, permite una discriminación

Además, asegúrese de que está enviando una muestra

clara de ciertos patógenos.

4.

5.

que tenga los síntomas más distintivos del problema que usted está obser vando (MIP Forestales, 2006).

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Notas

Figura1

2. Técnicas clásicas para el diagnóstico Un requisito previo para el co ntrol de c ualquier enfermedad es la detección e identificación apropiada del organismo causal. La detección de patógenos en plantas con síntomas puede ser relativamente simple si se tiene ex tensa ex per ienc ia co n el diagn óst ico de la en fer medad y aislamiento del patógen o. Po r otro lado la detección del patógeno en las semillas y materiales de propagación asintomática tales como: tubérculos de papa, pueden ser sumamente difíciles cuando la población de los patógenos es muy baja en los propágulos. Debido a esto se necesitan técnicas capaces de detectar un número bajo de patógenos en los propágulos. Antes del desarrollo de las técnicas

Figura 2

serológicas el único método disponible y fiable para la identificación de hongos y bacterias fue el aislamiento en medio de cultivo y prueba de

patogenicidad. Las

pruebas serológicas permiten el diagnóstico presuntivo de enfer medades bacterianas (Hampton, et al, 19 90). Sin embar go hasta que no se desar rollaro n las técn icas basadas en ADN, no se pudo det ectar los patógenos en plantas asintomáticas (Shaad and Frederik, 1992).

2.1 Empleo de medios selectivos Mediant e el empleo de medio s selec t ivo s se puede realizar una deter minación cuantitativa de la pob lación. Algunos medios selectivos se basan en Figura 3

las posibilidades de las bacterias de utilizar sustratos específicos. La presencia o ausencia de crecimiento y el color de las colonias son importantes (Disponible en http://www.apsnet.org/Education/Mlingual/ Spanish/8As.rtf). Ejemplo: Las especies del género Er winia causantes de pudrición producen enzimas peptolíticas que sir vieron de base par a la con fección de un medio selectivo que contiene polipectato sódico, las cavidades que se for man en la superficie del medio indican la presencia de microorganismos peptolíticos. Estas enzimas degradan las pectinas de la lámina media, causando el colapso del tejido, una pudrición blanda y la muerte de la célula (Disponible en http://www. apsnet.org/Education/Mlingual/Spanish/8As.rtf). Otros medios se basan en la tolerancia del patógeno a cierto número de antibióticos, fungicidas, bactericidas que los microorganismos saprófitos no toleran

El diagnóstico y su papel en la fitoprotección

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o no soportan en deter minadas concentraciones. Se

técn ica h a sido usada co n éxit o p ara detectar

emplean también diferentes colorantes que provocan

Clavibacter michiganense subps sepedonicum y

un crecimiento característico y desarrollo de colonias

Ralstonia solanacearum en papa y Xanthomonas

cuyo aspecto permite distinguirlas fácilmente de otros

albilineans en caña. El método es de 100 a 1000

que no se corresponde con el patógeno contaminante

veces más sensible que una aglutinación normal,

estudiado (Stefanova, et al,1986).

la reacción apar ece más rápida, generalmente

No resulta fácil crear un medio selectivo o semi-

no es necesario el microscopio para obser var la

selectivo para un deter minado patógeno porque hay

reacción, se necesita muy poco inmunosuero, no

que tener en cuenta su sensibilidad o sea la capacidad de recobrar la bacteria en concentraciones bajas

requiere la clarificación de la savia.

•

Técnica de Inmunofluorescencia: Esta técnica se

y suprimir en for ma eficiente la flora contaminante

basa en la conjugación de anticuerpos específicos

(Stefanova, et al, 1986).

con moléculas teñidas con productos, ejemplo, la fluoresceína, que produce un color verde amari-

2.2 Técnica de microscopía óptica y

llento. Es muy sensible para identificar bacterias

electrónica

fitopatógenas y útil para analizar un gran número

El empleo de estas técnicas se limita solamente a

de muestras. La técnica de inmunofluorescencia

la observación directa de las estr ucturas del patógeno

permite identificar un antígeno con la ayuda de un

en cuestión (Pupiro y Malagón, 2003).

inmunosuero conocido, e investigar y titular un anticuerpo con la ayuda de un antígeno conocido.

2.3 Técnicas serológicas El uso de inmunoensayos en la detección de pató-

Téc nica inmunoen zimát ica ELISA : El ensayo se basa en la interacción específica de un antígeno

genos de plantas ha sido rutinario en los últimos años,

(patógeno) y un anticuerpo (proteínas inmuno-

especialmente en virus (Clark , 1981 y Millar, 198 8).

globulinas producidas en un vertebrado superior,

Entre los más usados están:

usualmente conejos). La reacción se visualiza a

•

Método por aglutinación: Consiste en hacer reac-

través de la acción de un conjugado enzima-anti-

cionar cantidades equivalentes de los reactantes

cuerpo sobre un sustrato. Es un método rápido de

(Ag y Ac). La formación de gránulos aglutinados

gran sensibilidad, especificidad y bajo costo, que

o agr egado s in dican una reacción po sitiva. Las

supera a muchas técnicas de diagnóstico emplea-

reacciones de aglutinación son menos específicas

das con anterioridad. Existen diferentes variantes

pues tienen la desventaja de depender grande-

de la técnica de ELISA, todas basadas en el mismo

mente de los factores físico químicos, tales como,

principio. El tipo de técnica y anticuerpo a emplear

concentración de electrolitos, pH, temperatura y

dependerá del objetivo de la aplicación (campo,

el tiempo.

laboratorio), tipo de muestra (suelo, agua tejido) y

Método por precipitación: Pueden ser en medios

nivel de sensibilidad y rapidez requerida. La técni-

líquidos o en geles. Estos métodos han demostra-

ca ELISA con sandwich de doble anticuerpo es una

do tener una notable eficacia para individualizar

de las más empleadas, en este caso el antígeno

y p urificar los antíg enos dotados de dif erencias

es ubicado entre dos anticuerpos específicos, el

particulares. La unión del Ag y Ac se traduce por

de captura y el de marcaje, este último está con-

la for mación de un precipitado insoluble con la

jugado a una enzima y puede cuantificarse en el

condición que los reactivos se encuentren a con-

espectrofotómetro. Esta técnica es de gran utilidad

centración equivalente.

en la detección de patógenos de mezclas comple-

Mét odo del látex: E stá basado en la pr ueb a de

jas, tales como, suelo, extractos de plantas.

•

•

50

•

aglu tinació n. Los Ac son adher idos a p artícu las

Las técnicas de inmunodetección han sido usadas

de látex. Al enfrentarse el látex sensibilizado con

en la detección de microo rganismos fitopatógenos,

el Ag específico se p roduce la ag regación entre

principalmente virus y bacterias y en menor escala

estas esferas y los

Ag. Esta prueba ha sido usada

para hongos. Una aplicación importante se ha encon-

principalmente en V irología, en Bacteriolo gía la

trado en los estudios de taxonomía de microorganis-

Temas de Ciencia y Tecnología | mayo - agosto 2008

Notas

mos, la fisiología de la enfer medad y la ecología de

3. Técnicas avanzadas para el

los patógenos. Con el empleo de estas técnicas se

diagnóstico

pueden establecer estrategias de manejo de patógenos, como la certificación de semillas o fijación de cuarentenas (Tabla 1).

fun damental es la co mprensión de to dos aqu ello s procesos celulares que contribuyen a que la informa-

L as técnicas serológicas ELISA- Inmunofluorescen cia

Biolo gía Molecular, es la ciencia cu yo o bjetivo

además de ser mét odo s muy con fiab les y

sensibilidad moderada t ien e la vent aja de

p oder

asimilar gran cantidad de muestras en algunas horas y los resultados positivos y sospechosos se confirman mediante la pr ueba de patogenicidad (González, et al, 1999).

ción genét ica se transmita eficient emente de unos seres a otros y se exprese en los nuevos individuos, este con ocimiento nos permit e cr uzar las barrer as naturales que existen entre las especies y “colocar ” genes de u n organ ismo a otr o llamado hosp edero, empleando técnicas de ingeniería genética. Gracias a este avance, se pueden producir fragmentos de ácidos nucleicos a gran escala, abriendo así las puertas a la

Agente causal a

Phytophthora citrophthora

Cultivo

Técnica de diagnóstico

Cítricos

Hibridación dot-blot

secuenciación de los ácidos nucleicos y por ende a nuevas disciplinas como el diagnóstico molecular, la

Verticillium dahliae

a

Varias especies PCR de plantas

Verticillium albo-atrum

Pseudomonas syringae pv tomatoa

Tomate

Hibridación

Semillas de frijol

PCR

Cítricos

PCR

terapia génica o la obtención de organismos superiores

Según Salazar, citado por Pupiro y Malagón, 2003

lícolaa

PVY

b

b

Fusarium spp

(Disponible en: www.monogra-

fías.com).

Pseudomonas syringae pv phaseo-

VTC

recombinantes

c

Papa

PCR

Papa

AFLP

Frijol

PCR

Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens

d

PCR e

Xanthomonas axonopodis pv. citri

Cítricos IFI

Xanthomonas vasculorum

la caracterización genética de las plantas, donde no solamente se identifican genotípicamente los materiales, sino que se establecen relaciones citogenéticas entre los mismos, permitiendo el diseño de mejores estrategias de selección y mejoramiento genético.

f