Electrophorèse sur gel d\'agarose PDF

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Summary

Projet technique "électrophorèse sur gel d'agarose"...

Description

SELMANI Tamira GEORGES Manon TRAIN Maprao Groupe n°16 Sujet n°2 : Mutation et Mortalité ?

2020-2021

Electrophorèse sur gel d’Agarose Notre sujet porte sur une mutation identifiée dans un gène du coronavirus qui serait à l’origine de la COVID et donc de la mortalité qui y suit chez les personnes affectées. Le gène sous la forme « sauvage » a une faible mortalité contrairement au gène sous forme muté. Ce dernier serait fragmenté en 2 morceaux par une enzyme de restriction dont le gène y serait sensible. Nous devons trouver une technique qui pourrait visualiser et différencier ces deux gènes. Nous remarquons que la différence entre ces deux gènes est qu’avec l’ajout d’une enzyme de restriction, l’un se fragmente tandis que l’autre non. Nous nous sommes donc orientés vers la chromatographie qui est une méthode qui permet la séparation de différentes substances chimiques. Sachant que nous expérimentons sur deux gènes du coronavirus et que ces derniers comportent des charges négatives, nous allons donc utiliser l’électrophorèse sur gel d’agarose qui est une méthode en biologie moléculaire qui permet la fragmentation des acides nucléiques (ADN) sous l’effet d’un champ électrique. But : Le but étant de visualiser et de distinguer le gène sauvage, en comparant deux séquences d'ADN d'un gène sauvage (normal) et d’un autre gène muté. Principe : Afin de distinguer 2 gènes, il nous faut 2 échantillons d’individus malades. Un contaminé par le virus dont le gène est "sauvage" (A) et l’autre dont le gène est muté (B). On prélèvera un autre échantillon d'individu sain pour vérifier le bon fonctionnement de l'expérience. Ces échantillons qu’on prélèvera seront des cellules ciliées présentes dans le nez. On choisit de prélever ces cellules car même si on peut trouver le virus dans la salive et la gorge, il est davantage présent dans les cellules ciliées de l’arbre respiratoire, ainsi, le test sera fiable de 80 à 90%. On ajoute par la suite une enzyme de restriction dans les tubes à essai contenant les échantillons. Cette enzyme va fragmenter les séquences d’ADN à des endroits précis sous des conditions de température semblables à celle du corps humain (37°). Cette fragmentation va donc raccourcir la longueur de la chaine de nucléotides. En effet, les échantillons vont être placés comme sur la première image ci-dessous du côté de la borne négative du bac d'électrophorèse

→ Figure 1: échantillons placés dans un bac à électrophorèse

Initialement, l'électrophorèse sert à déplacer des ions sur une surface conductrice en y ajoutant un courant électrique faible (100 V dans notre cas). Lorsque le courant va traverser le gel d’Agarose, les fragments d’ADN chargés négativement vont migrer vers la borne positive du bac d'électrophorèse. Au cours de cette migration, les brins les plus petits vont se déplacer plus rapidement que les gros brins. Ainsi, en fin d’expérience, les plus petits brins d’ADN (préalablement fragmentés par l’enzyme de restriction) correspondant à l’échantillon d’ADN de l’individu ayant le virus muté vont être retrouvés au bout d’un certain temps (environs une heure) plus près de la borne positive (anode).

→ Figure 2 : migration des fragments d’ADN par un courant électrique

Le bromure d’éthidium est le marqueur moléculaire qui va nous permettre de distinguer les acides nucléiques présents dans le bac d’électrophorèse lorsqu’ils sont soumis à un rayon ultraviolet. L’électrophorèse sur gel d’agarose est utilisée dans la biologie moléculaire et est une technique permettant la migration des espèces chargées sous l’effet d’un champ électrique. Elle permet de visualiser en même temps plusieurs séquences d’ADN, ce qui va nous permettre de distinguer le gène sauvage et le gène muté identifiable dans le gène du coronavirus. Matériel :

Figure 3 : Bac à électrophorèse

Figure 4 : Générateur électrique

Figure 5 : Lampe à UV

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Enzyme de restriction

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4 Pipettes

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Gel d’agarose (1.0% masse volumique) = poudre blanche qui se dissout dans l’eau à ébullition.

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Cuve dans laquelle est placé le gel d’agarose

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Bac d'électrophorèse

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3 échantillons d’ADN (gène des cellules ciliées)

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Générateur électrique

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3 tubes à essai

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Deux fils électriques

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Lampe à UV

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Bromure d’éthidium : colorant fluorescent

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Tampon TBE

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Bain marie à 37°

Protocole : o

Prélever trois échantillons d'ADN nasal (cellules ciliées) sur deux individus malades (un portant le gène sauvage, et l'autre muté) et un témoin.

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Introduire les 3 échantillons dans 3 tubes à essai différents et rajouter l'enzyme de restriction dans chacun des tubes.

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Placer les tubes à essai à une température de 37° dans un bain marie pendant une trentaine de minutes afin de permettre la fragmentation de l'ADN.

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Dissoudre le gel d’agarose dans une solution de tampon TBE

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Placer le gel obtenu dans une cuve et le recouvrir de solution tampon.

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Prélever à l'aide de pipettes, des échantillons d’ADN de chaque tube, préalablement mélangés avec du colorant, et les placer dans des puits distincts dans la cuve à électrophorèse contenant le gel, du côté de la borne négative.

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Laisser un puit contenant l’échelle de marqueur de poids moléculaires.

Figure 6 : Méthode d'électrophorèse sur gel d'agarose

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Fermer la cuve et brancher le générateur électrique à l'aide de deux fils électriques au bac à électrophorèse à une tension de 100V.

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Attendre environs 1 heure la fin de la migration des fragments d'ADN de la cathode vers l’anode.

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Ajouter du bromure d’éthidium dans le bac d’électrophorèse et laisser agir de 1h à une nuit.

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Utiliser une lampe à rayons ultraviolets (de préférence dans l’obscurité) afin de voir les positions des différents brins.

Avantages et inconvénients : L’électrophorèse permet d’analyser et comparer plusieurs échantillons en même temps et le résultat de la séparation est net et précis. En effet, le gel d’agarose est un produit sûr et non toxique, il est également facile à manipuler car il est facilement modifiable. Ainsi, il coûte moins cher. Cette technique d’électrophorèse ne provoque pas de dénaturation, c’est-à-dire elle permet de garder la conformation tridimensionnelle des acides nucléiques, et ne sépare donc pas les brins d’ADN. Il existe néanmoins des inconvénients de cette technique d’électrophorèse, car l’opération peut durer de 1 heure à plusieurs jours en attendant la fin de la migration. Ainsi le matériel nécessaire pour cette technique est couteux et les données de la séparation ne sont pas toujours précises. Limites : La technique d’électrophorèse nous permet d’observer quelques fois certaines anomalies dues à la coloration (coloration insuffisante, taches sur le gel) ou bien sur la migration (bandes non alignées ou trop courtes) mais il existe aussi des anomalies dues à l’apparition de bandes anormales. Références bibliographiques : o

https://planet-vie.ens.fr/thematiques/electrophorese-d-adn-sur-gel-d-agarose

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https://www.fishersci.fr/shop/products/fermentas-10x-tbe-buffer-tris-borate-edta/10130 740

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http://www.handpuzzles.com/les-avantages-d-utiliser-electrophorese-sur-gel/

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https://www.medecinesciences.org/en/articles/medsci/full_html/2020/06/msc200106/msc2001 06.html

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https://www.lemonde.fr/les-decodeurs/article/2020/07/09/coronavirus-pourquoi-les-tests-pcrnecessitent-d-aller-au-fond-du-nez_6045725_4355770.html

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http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/ATP/bioch1.htm

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https://www.jeulin.fr/media/pim/assets/DocumentsPDF/std.lang.all/r-/en/Notice-591031-FR-EN .pdf

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https://fr.wikipedia.org/wiki/%C3%89lectrophor%C3%A8se_sur_gel_d%27agarose

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https://fr.slideshare.net/mobile/ahmedAITKHOUYA/lelectrophorse-et-lanalyse-mdicale

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http://eppdu78.unblog.fr/2011/03/01/electrophorese-des-proteines/...