UE 2 - Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes PDF

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Cours de PACES UE 2 sur l'éléctrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes...

Description

Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes Application aux protéines

L’électrophorèse est une technique séparative est basée sur l’utilisation d’un champ électrique. La technique d’électrophorèse dénaturante appelée aussi SDS-PAGE permet d’identifier et e suivre les protéines durant un protocole de purification et de vérifier l’homogénéité des fractions obtenues. Elle est utilisée pour séparer des mélanges complexes de protéines, pour estimer la masse moléculaire de sous-unités et pour déterminer la composition en sous-unités de protéines purifiées. Cette technique séparative comprend trois étapes : • Préparation du gel de polyacrylamide et couler ce gel ; • Migration des échantillons qui contiennent les molécules qui nous intéressent, par exemple des protéines ; • Coloration du gel pour visualiser les bandes obtenues après migration. Exemple de techniques utilisées pour la coloration ! coloration au bleu de Coomasie ! révélation au nitrate d’argent.

I- Préparation du gel de polyacrylamide Les gels de polyacrylamide sont des polymères faits à partir d’acrylamide, l’acrylamide est l’unité de base. Ils sont formés par copolymérisation de monomères d’acrylamide (CH2=CH-CO-NH2) et d’un agent pontant le bisacrylamide (CH2=CH-CO-NH-CH2NH-CO-CH=CH2). L’acrylamide va former des chaines et le bisacrylamide va ponter les chaines d’acrylamide. Le mécanisme de formation du gel est une polymérisation par addition vinyl. La réaction de polymérisation se fait grâce à l’ajout de deux substances : - le persulfate d’ammonium (APS) qui va initiée la réaction par la formation de radicaux libres ; -le TEMED (tétramethylethylènediamine) qui accélère la réaction. TEMED cancérigène et acrylamide toxique (une fois polymérisé il ne l’est plus) !

Les gels de polyacrylamide utilisés sont souvent caractérisés par la concentration en % total de l’ensemble des monomères (acrylamide et bisacrylamide) et la concentration en % de bisacrylamide relative à la concentration totale de monomères. Plus le pourcentage d’acrylamide est élevé, plus la densité des chaines est élevée et plus les mailles du gel sont serrées. Donc plus le pourcentage d’acrylamide est élevé, moins les grosses molécules peuvent migrer car elles sont ralenties par le maillage du gel.

• Initiation de la polymérisation

Le TEMED catalyse la décomposition des ions persulfates pour donner un radical libre R. R = SO4•

• Réaction de polymérisation avec R le radical et M le monomère d’acrylamide

• Polymérisation de la matrice de polyacrylamide avec l’agent pontant L’acrylamide se polymérise en longues chaines et, de temps en temps, une molécule de bisacrylamide est incorporée dans le polymère. La polymérisation continue jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de monomère d’acrylamide libre. La molécule de bisacrylamide permet de lier deux polymères d’acrylamide entre eux.

II- Dépôt des échantillons sur le gel Les échantillons sont, avant dépôt sur le gel, dilués dans un tampon de charge de faible conductivité pH 6,8 contenant : • Bleu de bromophénol ! indicateur de pH, à un pH basique il est bleu alors qu’à un pH acide il est jaune ; ! colorant qui permet de visualiser nos échantillons. • Glycérol ! qui alourdi nos échantillons ce qui nous permet de les déposer facilement au fond des puits du gel. • SDS ! détergeant anionique donc chargé négativement, il va se fixer sur la périphérie des chaines de protéines et leur conférer une charge totale négative. Cela dénature les protéines c’est pourquoi on parle d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes. La charge réelle des protéines n’est donc plus mise en jeu et donc seule leur masse moléculaire influencera leur migration. • β -mercaptonéthanol (DTT) ! agent réducteur qui va cliver les ponts disulfures de nos protéines ainsi les sousunités des protéines sont dissociées. Si on chauffe nos échantillons à 100°C pendant 10 minutes on va détruire les oligomères de protéines.

III- Migration des protéines Notre gel est fait de deux parties : la 1ère est le gel de concentration 5% d’acrylamide donc dans cette partie les mailles sont assez lâches il présente une faible conductivité pH6,8 et la 2ème partie est le gel de séparation 10% d’acrylamide donc les mailles sont resserrées et il présente une forte conductivité pH8,8. Ce gel baigne dans un tampon de migration qui présente une forte conductivité pH8,3 dans une cuve d’électrophorèse. Le tampon de migration est composé d’ions chlorure Cl- qui vont migrer rapidement et d’ions glycinates Gly- qui vont migrer lentement.

Les échantillons sont déposés dans les puits du gel. Quand le courant électrique est appliqué, une chute de tension se développe à travers la solution d’échantillon. Les protéines pénètrent dans le gel de concentration. Les protéines sont chargées négativement à cause du SDS donc elles vont migrer vers l’anode (+). Toutes les protéines migrent dans le gel de concentration, elles vont se concentrer à l’interface des deux parties du gel ; elles vont former une bande très fine à la frontière du gel de séparation. Ainsi les protéines vont entrer en même temps dans le gel de séparation. Les protéines de très haute masse moléculaire ne peuvent pas pénétrer dans le maillage serré du gel de séparation. Les ions glycinates deviennent beaucoup plus mobiles à l’interface entre le gel de concentration et le gel de séparation grâce au changement de pH (on passe de 6,8 à 8,8), ils dépassent la bande de protéines formée et entrent dans le gel de séparation. Les protéines de faible masse moléculaire sont entrainées dans le gel de séparation par ces ions. Les protéines peuvent donc se séparer selon leur masse moléculaire, les protéines de plus haute masse moléculaire seront retardées et les protéines de plus faible masse moléculaire migreront plus vite dans le gel de séparation.

IV- Coloration Après séparation des protéines par électrophorèse sur gel en conditions dénaturantes, le gel est démoulé et les bandes protéiques peuvent être visualisées par différentes techniques. Exemples : • Coloration au bleu de Coomassie Le bleu de Coomassie en milieu acide possède la particularité de se lier aux protéines en interagissant principalement avec les acides aminés basique et aromatiques. Les protéines sont fixées dans le gel (grâce à de l’acide acétique contenu dans le colorant) et le colorant se fixe aux protéines. L’excès de colorant est ensuite éliminé par lavage successif du gel dans une solution acide. • Coloration au nitrate d’argent Le mécanisme exact de cette coloration pour les gels de polyacrylamide n’est pas connu mais il semble impliquer un processus d’amplification où l’argent est déposé autocatalytiquement sur un site de nucléation initial. Ce site semblerait être un complexe entre l’ion argent et les chaines latérales de protéines. La réduction de l’ion argent en métal permet la visualisation des bandes de protéines sur le gel....