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PRÁCTICA: BACILOS GRAM NEGATIVOS IIObjetivos:  Identificar e interpretar el crecimiento de enterobacterias en medios selectivos.  Identificar e interpretar el crecimiento de enterobacterias en las pruebas bioquímicas e IMViC.ESTUDIO PRELIMINAR DE LOS CULTIVOS DE ENTEROBACTERIASEn cuanto al cultivo...

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PRÁCTICA:

BACILOS GRAM NEGATIVOS II

Objetivos:  Identificar e interpretar el crecimiento de enterobacterias en medios selectivos.  Identificar e interpretar el crecimiento de enterobacterias en las pruebas bioquímicas e IMViC.

ESTUDIO PRELIMINAR DE LOS CULTIVOS DE ENTEROBACTERIAS En cuanto al cultivo proveniente de muestras clínicas, las enterobacterias producen un crecimiento similar en agar sangre, y aparecen por lo general en forma de colonias grises relativamente grandes y brillantes, que pueden ser hemolíticas o no. Las especies que producen H2S muestran una zona verdosa definida alrededor de las colonias subsuperficiales en agar sangre. En el TSA, agar nutritivo o agar con infusión de carne, las colonias pueden variar de tamaño según el género, pero son generalmente blancogrisáceas, traslúcidas y ligeramente convexas. Algunas colonias son grandes y mucoides, como en el caso de Klebsiella, algunos tipos de Shigella y ciertas variantes de Salmonella. Es común la variación de colonias, que da lugar a formas lisas y rugosas. AGAR SANGRE

Para proceder al aislamiento es necesario tener al menos una sospecha de qué género podría ser, por ejemplo, a diferencia de Salmonella, si se intenta aislar de materia fecal, para Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter o Citrobacter, no se recomiendan caldos de enriquecimiento con tetrationato o selenito, porque inhiben a la mayoría de cepas de dichos géneros. En tales casos se emplearán medios menos inhibidores como Agar Mc Conkey o EMB para el aislamiento primario. Las formas lactosa negativas, como Salmonella y Shigella, dan lugar a pequeñas colonias incoloras en agares de desoxicolato citratado, McConkey, EMB. XLD y SS. Las colonias de microorganismos que fermentan lactosa en agar con desoxicolato citratado (si no son inhibidas), en agar McConkey y en SS aparecen rojas; en agar EMB se presentan de color púrpura oscuro a negro y a menudo tienen un reflejo metálico.

AGAR EMB

AGAR XLD

Sin embargo, a pesar de la utilización de medios de cultivo hay que tener en cuenta cualquier propiedad adicional de los diferentes géneros que permitan el aislamiento adecuado. Por ejemplo, para aumentar el aislamiento de Yersinia enterocolitica de muestras fecales se puede utilizar el enriquecimiento en frío.

OTRAS PRUEBAS IMPORTANTES La reacción IMViC se utiliza para distinguir entre las diversas especies de enterobacterias. Reacción de Indol: El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos indólicos: indol, metil indol y ácido indolacético. Las diversas enzimas intracelulares involucradas se denominan colectivamente “triptofanasa”, que designa el sistema completo de enzimas que median la producción de indol por actividad hidrolítica sobre el sustrato triptófano. Procedimiento: Se inocula un caldo triptófano o peptona. Incubar a 35-37°C por 24-48 h. Efectuar la prueba mediante el agregado directo del reactivo de Kovacs (solución alcohólica de pdimetilaminobenzaldehído en medio ácido). Si hay producción de indol, se combina con producción de color rojo en la capa de alcohol.

Reacción de Rojo de Metilo: La prueba de rojo de metilo es una prueba cuantitativa basada en el uso de un indicador de pH para determinar la concentración de H+ cuando un microorganismo fermenta la glucosa. La concentración de H+ depende de la relación de gases (CO2 y H2), lo que a su vez es un índice de las diferentes vías metabólicas de la glucosa exhibidas por los diversos microorganismos. Los diferentes patrones de fermentación se deben a las variaciones en las enzimas relacionadas con el metabolismo del ácido pirúvico en el microorganismo.

Todos los miembros de la familia son fermentadores de glucosa en el caldo MR-VP, después de 18-24 h de incubación, la fermentación resultante produce derivados metabólicos ácidos: en consecuencia, en un inicio todos los microorganismos entéricos, si se prueban darán una reacción RM (+). Sin embargo, luego de una incubación requerida de 2-5 días, los RM (+) continúan con la producción de ácidos, lo que origina un pH terminal bajo que vence el sistema de buffer fosfato y mantiene el medio ácido (pH 4,2 o menor). Los microorganismos RM (-) metabolizan aún más los productos de fermentación iniciales por descarboxilación para producir acetilmetilcarbinol neutro (acetoína), que produce una disminución de la acidez en el medio y eleva el pH hacia la neutralidad (pH 6 o mayor). La validez de esta prueba depende de la incubación lo suficientemente prolongada para permitir que ocurra la diferencia en el metabolismo de la glucosa. Procedimiento: Inocular medio MR-VP. Efectuar la prueba después de 48 a 96 horas, agregando V gotas de indicador rojo de metilo. El color rojo indica resultado positivo. El color amarillo se interpreta como negativo. Efectuar la lectura de la reacción inmediatamente después de haber agregado el reactivo.

Reacción de Voges-Proskauer: La prueba VP se basa en la detección de acetoína, un producto final neutro derivado del metabolismo de la glucosa. La glucosa es metabolizada a ácido pirúvico, el principal intermediario en la glucólisis. A partir del ácido pirúvico, las bacterias pueden seguir muchos caminos metabólicos: la producción de acetoína es una de las vías metabólicas de la degradación de la glucosa en las bacterias. La prueba VP para la acetoína se utiliza principalmente para separar Escherichia coli de los grupos Klebsiella-Enterobacter, aunque otros miembros de la familia pueden producir VP (+). Procedimiento: Inocular el medio MR-VP y ensayar la producción de acetil-metil carbinol después de 48 h de incubación, agregando a 1 mL de cultivo XV gotas de alfa naftol 5% en alcohol etílico absoluto y X gotas de KOH 40%. Mediante una pipeta se puede pasar el volumen de cultivo necesario a un pequeño

tubo antes de efectuar la reacción de rojo de metilo. La aparición de color rojo entre los 15 y 30 minutos, indica reacción positiva.

Reacción del citrato: La energía puede ser proporcionada a algunas bacterias en ausencia de fermentación o producción de ácido láctico por la utilización de citrato como única fuente de carbono. En condiciones normales, el metabolismo del citrato involucra una condensación de acetilo de coenzima A y oxalacetato para ingresar en el ciclo de Krebs. Las bacterias que poseen un mecanismo de transporte o permeasa permiten que el citrato penetre al interior de la célula. El desdoblamiento enzimático por la citratasa requiere de un catión divalente para su actividad. El medio también debe contener sales de amonio. Una bacteria que utiliza el citrato como única fuente de carbono también utiliza las sales de amonio como única fuente de nitrógeno. Las ales de amonio son degradadas a amoníaco e hidróxido de amonio, lo cual aumenta la alcalinidad Procedimiento: Inocular agar citrato de Simmons con un inóculo pequeño. La reacción positiva está indicada por la aparición en el medio de un color azul de Prusia, lo que demuestra que el microorganismo puede utilizar el citrato como única fuente de carbono.

PRÁCTICA

MATERIALES: Material biológico:    

Klebsiella Enterobacter Proteus Serratia

Medios de cultivo:        

Agar Mc Conkey Agar EMB Agar SS Agar XLD Agar TSI Agar LIA Agar Citrato de Simmons Medio MIO

Reactivos: 

Reactivo de Kovacs

PROCEDIMIENTO Para aislar enterobacterias a partir de diferentes muestras se puede utilizar medios selectivos donde se observará la morfología, color y otras características de las colonias. Para ello se inocula un microorganismo en cada uno de los medios de cultivo (agar McConkey, agar ENDO y agar XLD). Luego se deja incubar a 37°C por 24 h .

MAC

ENDO

XLD

IDENTIFICACIÓN      

Se debe trabajar con las colonias aisladas, de preferencia del agar Mac Conkey En el agar TSI se inocula con asa de Kolle en aguja hasta los 2/3 del agar y al retirar se hace estrías en la parte inclinada. En el agar LIA se inocula con asa de Kolle en aguja, picando dos veces hasta los 2/3 del agar y al retirar el asa se hace estrías en la parte inclinada. En el agar Citrato se siembra con el asa en aguja en forma de estrías en la parte inclinada. En el medio MIO se siembra con el asa de kolle en aguja hasta los 2/3 del medio. Se incuban todos los tubos de pruebas bioquímicas a 37°C por 18 a 24 h.

INTERPRETACIÓN 

Agar TSI (Triple-Sugar-Iron) - Pico alcalino/profundidad ácida (pico rojo/fondo amarillo = K/A): el microorganismo solamente fermenta glucosa. - Pico ácido/profundidad ácida (pico amarillo/fondo amarillo = A/A): el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa. - Pico alcalino/profundidad alcalina (pico rojo/fondo rojo = K/K): el microorganismo no fermenta azúcares. - Presencia de burbujas o ruptura del medio de cultivo indican que el microorganismo produce gas. - El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce H2S.



Agar LIA (Lysine-Iron-Agar) - Descarboxilación de la lisina: Resultado positivo: pico alcalino (violeta)/profundidad alcalina (violeta). Resultado negativo: pico alcalino (violeta)/profundidad ácida (amarillo). - Desaminación de la lisina: Pico rojizo/profundidad ácida. - Producción de H2S: Ennegrecimiento del medio.



Agar Citrato de Simmons: - Positivo: crecimiento bacteriano con un intenso color azul. - Negativo: ausencia de crecimiento y permanencia de color verde del medio de cultivo.



Medio MIO: - Movilidad: Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento más allá de la línea de siembra. Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra. - Ornitina descarboxilasa: Resultado positivo: color púrpura. Resultado negativo: color amarillo, a veces se puede desarrollar un color violáceo en la superficie del medio. - Prueba de indol: Después de realizar las lecturas de movilidad y descarboxilación de ornitina, agregar gotas del reactivo de Kovacs. Resultado positivo: color rojo. Resultado negativo: el color del reactivo permanece incoloro-amarillento.

CUESTIONARIO

1. Explique el “swarming” en Proteus. 2. ¿Cuáles son las enterobacterias oportunistas que más se asocian a infecciones? Sustente con datos estadísticos (Revise boletines epidemiológicos). 3. ¿Por qué el color de las colonias de Escherichia coli y Enterobacter no es igual? 4. ¿Cuáles son los resultados de las pruebas bioquímicas para Citrobacter?...