ENZIM RESTRIKSI PDF

Preview

Summary

ENZIM RESTRIKSI Oleh Viki Wulandari (H41112 009) [email protected] Teknik manipulasi DNA melibatkan beberapa enzim, diantaranya DNA polimerase, ligase, enzim yang memodifikasi ujung akhir nukleotida dan nuklease. Nuklease merupakan enzim yang memotong molekul DNA dengan memutuskan ikatan fos...

Description

ENZIM RESTRIKSI Oleh Viki Wulandari (H41112 009) [email protected] Teknik manipulasi DNA melibatkan beberapa enzim, diantaranya DNA polimerase, ligase, enzim yang memodifikasi ujung akhir nukleotida dan nuklease. Nuklease merupakan enzim yang memotong molekul DNA dengan

memutuskan ikatan

fosfodiester

antara

nukleotida

satu

dengan

nukleotida berikutnya. Jenis nuklease ada dua yaitu eksonuklease dan endonuklease.

Endonuklease

merupakan nuklease yang memotong bagian

internal DNA tepat pada ikatan fosfodiester. Hasil pemotongan molekul DNA oleh enzim restriksi endonuklease tepat pada urutan tertentu dan menghasilkan sekuens yang double-stranded, dengan demikian sekuens yang akan dipotong dapat diprediksi urutan basa nitrogennya. Sekuen pengenalan atau sering disebut juga situs pengenalan merupakan sekuen DNA yang menjadi tempat menempelnya enzim restriksi dan melakukan pemotongan pada sekuen tersebut. Panjang sekuen pengenalan enzim restriksi berbeda-beda, seperti enzim EcoRI, SacI, dan SstI mempunyai sekuen pengenalan sepanjang 6 pasang basa, sedangkan NotI 8 pasang basa, dan Sau3AI hanya 4 pasang basa. Kebanyakan dari enzim restriksi bersifat palindromik (palindromic) yang berarti sekuen pengenalan sama jika dibaca dari 5’  3’ baik utas atas maupun utas bawah. Contohnya adalah HindIII dengan situs pengenalan 5’AAGCTT-3’ (utas atas)/3’-TTCGAA-5’ (utas bawah). Ada tiga tipe enzim restriksi endonuklease yaitu tipe I, II dan III. Enzim restriksi endonuklease tipe I dan III jarang digunakan, karena hasil pemotongannya tidak tepat pada sekuens yang diinginkan, sedangkan enzim

restriksi endonuklease tipe II dapat memotong tepat atau dekat dengan sekuens yang diinginkan.

Gambar 1. Pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi endonuklease tipe I, II, dan III. Sumber : Hirma et al, 2008 Enzim-enzim tipe I merupakan enzim yang kompleks, multisubunit, kombinasi antara restriksi dan pemodifikasi yang memotong DNA pada area random yang jauh dari sisi pengenalan. Enzim tipe I secara biokimia mungkin banyak berfungsi di dalam sel, tetapi mereka kurang menguntungkan untuk digunakan dalam percobaan di laboratorium. Enzim tipe II memotong DNA pada posisi tertentu yang dekat atau berada di antara sekuen yang dikenalnya. Enzim tipe II menghasilkan fragmen-fragmen tertentu dengan pola pita-pita yang spesifik pada gel agarosa. Enzim tipe inilah yang dipakai untuk berbagai percobaan dalam analisis DNA dan kloning gen. Enzim tipe II yang umum digunakan adalah HhaI, HindIII, EcoRI, dan NotI, dan enzim-enzim tersebut tersedia secara komersil. Enzim tipe III juga merupakan kombinasi restriksi dan enzim pemodifikasi.

Enzim ini memotong DNA di luar sekuen yang dikenal dan memerlukan 2 sekuen yang sama pada orientasi yang berlawanan pada untai DNA yang sama untuk dapat memotong. Enzim-enzim ini jarang menghasilkan potongan yang sempurna. Enzim restriksi merupakan enzim yang tidak stabil. Oleh karena itu, sebaiknya disimpan pada suhu -20C untuk sebagian besar enzim. Beberapa enzim perlu disimpan pada -70C. Enzim ini harus tetap disimpan di dalam es ketika dikeluarkan dari freezer dan harus selalu menjadi komponen yang ditambahkan terakhir pada campuran reaksi. Selain stabilitas, harga enzim restriksi pun mahal. Campur reaksi dengan baik dengan cara pemipetan atau menggoyang (tapping) tabung reaksi. Sentrifus dengan cepat selama beberapa detik jika ada cairan yang menempel di dinding tabung. Enzim restriksi yang mempunyai sekuen pengenalan yang pendek akan menghasilkan banyak potongan DNA sedangkan jika mempunyai sekuen pengenalan yang panjang, akan dihasilkan potongan DNA yang lebih sedikit. Baik enzim yang mempunyai sekuen pemotongan pendek maupun panjang, mempunyai fungsi masing-masing dalam rekayasa genetika. Beberapa enzim sering yang digunakan dalam laboratorium dibagi menjadi tiga berdasarkan perkiraan pemotongan: 1.

6-cutters Ezim restriksi yang tergolong dalam 6-cutters memiliki situs pemotongan

yang

spesifik

pada

6

nukleotida. Ezim

ini

cocok

digunakan

untuk

pekerjaan kloning sehari-hari karena enzim ini lumayan sering memotong satu atau dua situs pada plasmid, namun jarang memotong bagian penting seperti titik asal replikasi (origin of replication) atau gen resisten ampisilin.

2.

8-cutters Enzim restriksi ini mempunyai situs pengenalan sepanjang 8 nukleotida;

cocok digunakan untuk membentuk kromosommenjadi potongan-potongan yang spesifik dalam ukuran yang besar. Sebagai contoh: PacI (enzim 8-cutters) memotong-motong kromosom E. coli menjadi 20 bagian, sedangkan BamHI (enzim 6-cutters) memotong sekitar 300 bagian. Jika langsung menggunakan enzim 6-cutters, maka fragmen yang dihasilkan terlalu kecil dan banyak. Untuk itu digunakan enzim 8-cutters terlebih dahulu, kemudian dilanjutkan dengan menggunakan enzim 6-cutters. 3.

4-cutters Enzim restriksi ini cocok untuk percobaan yang menginginkan

pemotongan pada beberapa situs yang potensial. Contohnya: jika ingin mengumpulkan fragmen DNA secara acak, dan pada potongan tersebut terdapat gen yang diinginkan; dapat dilakukan digestsi parsial (partial digestion) menggunakan enzim 4-cutters. Pada dasarnya, penamaan enzim restriksi diambil dari nama bakteri yang menghasilkan enzim tersebut. Seperti contohnya enzim EcoRI yang memiliki pola:

Enzim restriksi yang biasa digunakan dalam laboratorium biologi molekuler memotong molekul DNA pada situs pengenalan dan menghasilkan

salah satu dari ketiga jenis pola hasil pemotongan. Ketiga pola hasil pemotongan enzim restriksi sebagai berikut: 1) Ujung menggantung 5’ Enzim restriksi memotong secara asimetris pada situs pemotongan, menghasilkan hasil pemotongan memanjang pada ujung 5’. Contoh enzim yang menghasilkan ujung menggantung 5’ adalah BamHI.

2) Ujung menggantung 3’ Enzim restriksi ini juga memotong secara asimetris pada situs pengenalan, namun menghasilkan hasil pemotongan memanjang pada ujung 3’. Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini adalah KpnI.

3) Ujung tumpul Enzim ini memotong secara simetris antara kedua utas DNA sehingga menghasilkan ujung tumpul. Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini adalah SmaI.

Gambar 2. (a) Pola pemotongan ujung menggantung 5’, (b) Pola pemotongan ujung menggantung 3’, dan (3) Pola pemotongan ujung tumpul. Sumber : http://sivitas.lipi.go.id Pola ujung menggantung, baik yang 3’ ataupun 5’, sering disebut juga dengan ujung lengket (sticky ends) atau ujung kohesif (cohesive ends). Pola seperti ini lebih mudah menempel (annealing) dengan pasangan DNA nya karena adanya ikatan basa antara ujung-ujung yang menggantung. Hasil pemotongan enzim restriksi endonuklease ada dua macam yaitu unjung blunt atau flush dan ujung sticky atau cohesive. Ujung blunt atau flush menghasilkan fragmen

yang double-stranded, sedangkan ujung sticky atau

cohesive menunjukkan enzim restriksi endonuklease pada posisi yang berbeda dari dua untai DNA yang komplementer. Beberapa pemotong ujung sticky menghasilkan ujung 5’ atau ujung 3’ yang menggantung. Fragmen DNA yang dipotong dengan enzim restriksi endonuklease dapat ditentukan berapa besar

ukurannya dengan menggunakan teknik elektroforesis gel agarosa. Teknik ini tergantung oleh konsentrasi agarosa dalam gel. Fragmen yang berukuran kurang dari 150 pasang basa dapat dipisahkan dengan cara elektroforesis yang konsentrasi agarosanya 4% atau 5%.

Gambar 2. Hasil pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi endonuklease berbeda. (A) ujung blunt dan ujung sticky. (B) Tipe ujung sticky berbeda. (C) Tipe ujung sticky sama dihasilkan oleh dua enzim restriksi endonuklease berbeda. Sumber : Hirma et al, 2008

Apabila ukuran dari sekuens DNA tidak diketahui maka fragmen yang mengandung gen atau segmen DNA tersebut dapat diidentifikasi dengan Southern hybridization. Adapun tahapannya yaitu: 

Mentransfer fragmen restriksi dari gel agarosa ke nitroselulosa atau membran nilon.



Menyediakan

hybrization

probe.

Sekuens

molekul

DNA

yang

komplementer dengan DNA target dilabeli. Pelabelan ini dapat menggunakan oligonukleotida sintetik. Pelabelan kemudian dideteksi dengan menggunakan autoradiography. Contoh enzim restriksi endonuklease tipe II adalah EcoRI. Enzim EcoRI diisolasi dari E. coli dan memotong molekul DNA pada urutan heksanukleotida 5’-GAATTC-3’. Selain EcoRI, enzim restriksi endonuklease lainnya dapat dilihat pada tabel. Stok enzim yang dibeli secara komersial biasanya disimpan dalam campuran yang mengandung gliserol, untuk itu, pada pemakaian enzim, sebaiknya digunakan larutan akhir sekitar 10x stok awal agar enzim dapat bekerja dengan baik. Untuk menghentikan reaksi enzim, dapat dilakukan penambahan stopper reagent yang mengandung SDS-EDTA. Ada beberapa faktor kunci yang harus diperhatikan untuk melakukan pemotongan dengan enzim restriksi (enzyme digestion). Di antaranya adalah: gunakan jumlah DNA, enzim, dan buffer yang benar dalam volume reaksi total yang sesuai. Satu unit enzim restriksi akan memotong 1 ug DNA secara sempurna dalam 50 ul reaksi selama 1 jam. Rasio enzim : DNA : volume reaksi ini dapat digunakan sebagai pedoman dalam menentukan reaksi. Meskipun demikian,

sebagian besar peneliti mengikuti pedoman umum reaksi digesti di mana 10 kali over-digesti direkomendasikan untuk mengatasi variasi dalam sumber, jumlah, dan kemurnian DNA. DNA harus terbebas dari kontaminan seperti fenol, kloroform, alkohol, EDTA, deterjen (SDS), atau garam yang berlebih. Metilasi DNA dapat mengakibatkan penghambatan digesti dengan enzim tertentu. DNA plasmid superkoil dan DNA yang terikat gel agarosa pada umumnya memerlukan lebih dari 1 unit/ug untuk dapat terpotong sempurna.

Tabel 1. Contoh enzim restriksi yang umum digunakan Sumber : Hirma et al, 2008

Pada tahapan kloning gen, DNA asing akan dimasukkan ke dalam vektor kloning (agen pembawa DNA), contohnya plasmid (DNA yang digunakan untuk transfer gen). Kemudian, vektor kloning akan dimasukkan ke dalam bakteri sehingga

DNA

yang

diinginkan

dapat

perkembangbiakan bakteritersebut. Apabila

diperbanyak gen

yang

seiring diinginkan

dengan telah

diperbanyak dalam jumlah yang cukup maka akan dilakukan transfer gen asing tersebut ke dalam sel tumbuhan yang berasal dari bagian tertentu, salah satunya adalah bagian daun. Suatu fragmen DNA yang mengandung gen target yang akan diklon pada molekul DNA sirkular (plasmid) yang disebut vektor untuk menghasilkan suatu molekul DNA rekombinan.

DAFTAR PUSTAKA

Aryati, G. Y., 2010. Enzim Restriksi dan Model Pemotongannya. Universitas Pendidikan Indonesia. Bandung. Hirma, R. D., Hariyati, dan Afrina, Y., 2008. Pemotongan Molekul DNA Menggunakan Enzim Restriksi Endonuklease dan Pengukuran Besarnya Pasangan Basa dari Fragmen yang Terpotong. Universitas Brawijaya. Malang. Oktahidayat, D. K., 2008. Enzim Restriksi: Jenis-Jenis dan Mekanisme Kerja Enzim Restriksi. Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar. Makassar. Septisetyani, E. P., 2012. Mengenal Enzim Restriksi Endonuklease http://www.sivitas.lipi.go.id (online), diakses pada hari Kamis, 25 Desember 2014 pukul 20.00 WITA, Makassar. Trimanjuniarso, 2012. Enzim: Sifat-Sifat Umum. Universitas Sumatera Utara. Medan. Medan. Yohannes, H., 2011. Enzim Restriksi - Marine Biodiversity of Raja Ampat Islands

http://www.ibcraja4.org (online), diakses pada hari Kamis, 25 Desember 2014 pukul 20.05, Makassar. Zulfikar, J., Ambarwati, Hilmar, H., 2012. Enzim Restriksi Endonuklease dan Vektor http://file.upi.edu (online), diakses pada hari Kamis, 25 Desember 2014 pukul 19.00 WITA, Makassar....