Estructura De Macromoléculas PDF

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Resúmenes temas 1 y 2 de la asignatura estructura de macromoléculas del segundo año de bioquímica. Profesor Antonio Jesus Diaz Quintana ...

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“Small angle X-ray scattering”

1.- Dispersión de ondas 2.- Dispersión de rayos X a bajo ángulo 3.- Modelado de la molécula · Ajuste de coordenadas · Modelado ab initio

La dispersión de rayos X de ángulo pequeño sirve para partículas de hasta casi 1nm, lo que permite observar desde pequeños orgánicos hasta macromoléculas. Cada técnica es apropiada para unos tamaños concretos (rangos). El uso de la SAXS es sobretodo para probar las propiedades físicas de las biomoléculas e incluso de células. El principio básico de SAXS es la dispersión elástica y de pequeño ángulo de los fotones de rayos X (radiación sincotrón) al atravesar un haz monocromático de estos una disolución de moléculas. Se registra la intensidad de la radiación dispersada en función del ángulo de dispersión.

: Por tanto, otra forma de expresar el principio de incertidumbre es con la h teclada multiplicada por el nº de onda , tal y como se ve en la ecuación. Donde p = momento, = número de onda = 2 / , h = h/2 y h= cte de Planck La dispersión de una onda (e , n, rayos X) implica: • Cambios en el momento asociado: si sólo cambia el momento, la colisión es elástica. Se puede cambiar el momento sin cambiar la energía cambiando únicamente la dirección de la velocidad. En el caso contrario, si se cambia la energía, es una colisión inelástica. • Si definimos la transferencia de momento Q: consiste en un cambio en el número de ondas. Q=ki-kf * Q en muchos textos se denota como S

• Cambios en su energía: Se puede representar la energía de la onda a través de la frecuencia ( Ecuación de Planck: ). La colisión es inelástica porque hay un cambio de energía. Si se cambia la energía, cambia también el momento.

: 1.- Elástica: • Se produce un cambio de momento: • La energía se mantiene: • Como = 0, la longitud de onda no cambia y por tanto el módulo de la transferencia de momento (Q) es nulo: 2.- Ineslática: • Varían tanto el momento como la energía.

Por geometría, se puede expresar el módulo de la transferencia de momento en una dispersión elástica (en la que solo cambia el momento y no la energía) de la forma expresada más arriba.

: La onda incidente es una onda plana (colimada) y su ecuación de onda: Cuando esta llega al átomo y colisiona, deja de ser una onda plana y se dispersa de forma radial, dejando de estar colimada. A medida que la onda se va dispersando, la intensidad va decreciendo hasta que esta se hace 0.

Para los neutrones: es una función que no depende del ángulo de dispersión. Esta función tiende a 0 (la intensidad de la onda tiende a 0), que no depende ni de ni del ángulo ( ), que es un parámetro -b (longitud de dispersión) - Es específico del isótopo. - Tiene dos valores cuando el núcleo es paramagnético. - Varía con el número atómico, pero de forma compleja. Los neutrones chocan directamente con el núcleo, no chocan contra los electrones. En ausencia de absorción del fotón por los electrones del átomo, - Es una función real. - Monotónica decreciente: tiende a 0. - Tiene el mismo signo para todos los elementos. - Su magnitud depende del número atómico Z. - Depende de Q y, por tanto, de y . En este caso,

:

recibe el nombre de factor de forma atómico:

La técnica consiste en colocar la muestra en una disolución en un capilar. Se acopla a una cromatografía. Se tiene que hacer un análisis de la muestra y un análisis del tampón. Una disolución de macromoléculas dispersa elásticamente un haz de rayos X y se registra la intensidad dispersada (I) en función de la transferencia de momento (Q). Se obtiene la dispersión de todos los átomos de la proteína, que es suma de todas las ondas que están llegando al detector.

La mayoría de los fotones no se desviarán, sino que atravesarán la muestra sin interactuar con ella. Por este motivo, la técnica da lugar a un característico patrón circular de mayor intensidad por el centro que en la periferia.

¿PARA QUÉ SIRVE EL SAXS? • Técnica estructural de baja resolución - Alta resolución si se combina con modelos moleculares • Muestra arquitectura macromolecular (forma) • No hay límite de tamaño • Muestra datos importantes sobre: - Calidad de las muestras - Dimensiones y densidad de las partículas · Radio de giro (R ) · Distancia máxima entre átomos (Dmax) · Volumen y masa molecular · Longitud - Flexibilidad conformacional

El perfil de intensidad dispersada (I) y la transferencia de momento (Q) (~ ángulo de dispersión 2 ) depende de la forma y el tamaño de la molécula.

Las proteínas agregadas muestran un pico de mayor intensidad. La máxima intensidad se alcanza en ángulos pequeños. En cuanto vamos avanzando, la intensidad va decayendo y , por tanto, el ruido es mayor. Eso hace que los datos de la cola estén más dispersos.

Representación de KRATKY: - Proteína plegada suele dar un máximo bien definido - Proteína desplegada suele presentar “colas” Si las colas van hacia arriba es algo típico de una proteína desplegada

Dominio globular: - Forma de campana entre s de 0.8 y 1.5 - Si una parte sube (en este caso la final)

quiere decir que hay una proteína plegada es que tiene una parte flexible

: De los datos se puede obtener inicialmente: • Estado de la molécula - Rígida o flexible - Forma (globular u otras) • Volumen de la molécula - Estimación de la masa • Radio de giro de la molécula • Distancia máxima (Dmáx) entre átomos El análisis de Guinier nos da cierta información sobre el volumen de la muestra, la distancia máxima y el radio de giro.

De este análisis podemos conocer el estado de la molécula (rigidez, forma-globular), y una estimación de la masa. el radio de giro nos lo permite saber si nuestra molécula es compacta o dispersa. Si el Rg es grande, pero la distancia máxima es pequeña, la forma de la molécula será esférica. Si es al contrario, la molécula tendrá forma alargada.

SAXS proporciona información precisa sobre la forma de las macromoléculas. El modelado de la estructura requiere del conocimiento de las estructuras tridimensionales. SAXS docking: Basándonos en un método ab initio (desde el principio) o en un modelo, podemos obtener la envolvente (forma de la molécula) mediante operaciones matemáticas. Hay modelos de estructura tridimensional de la proteína que se intenta encajar dentro de esa envolvente. Este fenómeno se conoce como docking.

: 1.- La dispersión de rayos X depende de: - La naturaleza de los compuestos: composición (Z), tamaño y forma, y flexibilidad. 2.- La dispersión de rayos X decae monotónicamente al aumentar el momento de transferencia Q. 3.- SAXS rinde información estructural de baja resolución (>1nm) a partir de muestras en disolución. 4.- Es necesario sustraer el patrón de dispersión del tampón. 5.- La calidad de las muestras es la clave.

1.- Introducción - Ondas y resolución óptica 2.- La imagen en microscopía electrónica: TEM y SEM - Tinción negativa - Criomicroscopía y contraste de fase - Tomografía 3.- Selección de partículas aisladas y reconstrucción 3D

COMPARACIÓN DE TÉCNICAS ESTRUCTURALES: La longitud de onda determina lo que podemos ver. • Microscopía óptica: utiliza la longitud de onda de la lux visibles (350-800nm), y se pueden apreciar tejidos, células y orgánulos. • Dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS): la luz choca con las partículas y se ve el reflejo. Orgánulos y macromoléculas (hasta unos 10 nm). • Microscopía de fuerza atómica (AFM): es capaz de detectar la topografía de una muestra. Permite observar células, orgánulos y macromoléculas. • Microscopía electrónica: células , orgánulos y macromoléculas (hasta 1nm aproximadamente) • Difracción de rayos X: la resolución es mejor porque la longitud de onda es menor. Desventajas: demanda muestra, cristales y problemas de las fases. Se pueden observar órganulos y macromoléculas. Requiere cristales, la resolución es atómica y la conformación puede verse afectada por la red cristalina. • Resonancia magnética nuclear (RMN): no es una técnica óptica , es espectroscopia. No nos da la información directa óptica, sino que hay que calcularla después. Se basa en principios químico-físicos de la molécula. Con ella se puede conocer información sobre macromoléculas. Alta resolución, da información sobre la dinámica y tiene un límite de masa molecular.

Con el experimento de Young (de doble rendija), se supo que la luz es una onda. Consistía en hacer pasar la luz por una pared con dos rejillas. En el experimento se puede ver que los rayos dispersados por las rejillas son ondas, y sufren fenómenos de interferencias constructivas y destructivas. Por ello, en la pared en la que se proyecta se obtienen zonas de luz y zonas de sombra. No obstante, si la distancia entre las rejillas es baja (cercana a la longitud de onda), se hace borrosa la imagen. Fresnel continuó con esta teoría y demostró en su experimento que el comportamiento de la luz no podía explicarse como si fueran partículas, sino como ondas. Predijo que, al hacer pasar luz monocromática a través de un disco opaco, debía aparecer un punto luminoso justo en el centro de la imagen.

: La luz que dispersa el objeto se hace pasar por la lente objetivo y eso genera una imagen en la pantalla. El límite de resolución (mínima distancia entre dos objetos para que se les pueda diferenciar) es directamente proporcional a la longitud de onda e inversamente proporcional al número de apertura.

En microscopía óptica, se incide la luz sobre una lente condensadora que da un objeto colimado. Posteriormente, está la lente objetivo que ya proyectará la imagen.

El problema es que la luz visible tiene como mucho una longitud de onda alrededor de los 600nm, por lo que no podemos usarlas para observar estructuras del orden de Armstrong. Como se ve en la fórmula, cuanto menor sea la longitud de onda usada, más pequeño será el límite de resolución, y por tanto, mejor se verá la imagen (mejor resolución).

: Hipótesis de De Broglie: toda la materia presenta características tanto ondulatorias como corpusculares comportándose como uno u otro modo dependiendo del experimento específico.

Los rayos X no se pueden enfocar con lentes. Por ello, en el caso de la microscopía electrónica, vamos a utilizar un haz de electrones, que tienen una mucho menor que la luz visible (mejor resolución). Estos se comportan como una ondapartícula, y a partir de la hipótesis vista se puede conocer la longitud de onda del electrón. Si se acelera el electrón, se puede obtener longitudes de onda más pequeñas. Podemos acelerar los electrones aumentando su energía cinética: A medida que se acelera el electrón, la masa aumenta. Cuando la velocidad tiende a la velocidad de la luz, resulta que la masa se hace infinita según la siguiente ecuación:

: Los electrones son generados por un pequeño dispositivo que consiste en un alambre que produce los electrones por el llamado efecto termoiónico. Es una lámpara que se calienta y está sometida a altas tensiones que genera electrones a gran velocidad. La imagen en microscopía electrónica se registra en una pantalla. Las lentes potenciadas enfocan la luz hacia el objeto o simplemente para permitir que pase. - Wolframio / Hexaboruro de lantano - El dispositivo Wehnelt estrecha el haz de electrones - El ánodo circular permite la aceleración del haz

: Son electroimanes. Están muy bien alineados para crear el campo magnético deseado, generado por unas bovinas eléctricas. Cuando el electrón pasa por uno de estos electroimanes, por las interacciones electromagnéticas (ya que el electrón está cargado positivamente), comienza a girar.

Un ME consta de una fuente de e- que van a atravesar lentes magnéticas, que son electroimanes que generan campos magnéticos para desviar a los e- y generar una trayectoria en forma de cono. Consecuencia de estas lentes: resolución que se puede conseguir es hasta 20 veces menor. Ya que los e- interacciones fuertemente con la materia, no se necesita mucha cantidad de muestra para esta técnica, aunque por la misma razón dicha interacción puede alterar la muestra biológica. Además, como la muestra debe encontrarse en vacío para evitar que los e- interaccionen con el aire, esta puede deshidratarse.

: • TEM (transmisión): detección de electrones tras las muestra (dispersión de e-). El haz de electrones atraviesa la muestra y observamos la sombra de la muestra (los electrones no absorbidos o reflejados). El detector se ubica debajo de la muestra. • SEM (Barrido): se observan los electrones desviados por la muestra (primarios), es decir, aquellos que al chocar con zonas de la muestra ricas en electrones son dispersados hacia algún lado; y aquellos eyectado por la muestra tras el bombardeo (secundarios). El detector se ubica a un lado de la muestra.

): Se obtiene una imagen de la sombra de la muestra, consecuencia de que los e- que han encontrado la muestra a su paso han interaccionado con ella y no se han podido recoger en la placa fotográfica. Es por ello que ofrece una primera imagen de la partícula (la envolvente, el perfil) a partir de la cual puede deducirse la simetría interna. Los electrones pueden ir directamente a la pantalla, a la muestra o ser dispersados por toda la pantalla tras chocar con la muestra: van a tener interferencias entre ellos (como pasaba en el experimento de Young) ya que se comportan como ondas. Este hecho es el principal responsable de la falta de contraste entre la imagen y el fondo.

Dispersión del haz e imagen: Formación de la imagen: • La muestra dispersa electrones • Las interferencias entre los electrones dispersos y los intactos rinde contraste de fase. • La imagen es la proyección bidimensional de un objeto tridimensional. • La estructura tridimensional se obtiene a partir de proyecciones desde orientaciones diferentes. • El límite inferior absoluto de resolución lo marca el daño a la muestra por radiación.

Cuando se reabsorbe la energía del electrón, un e- es eyectado y otro de una cara superior cae hacia un estado de energía inferior, lo que provoca una radiación (rayos X). La dispersión de los electrones puede ser elástica o inelástica. Una vez que el e- incide en la muestra, y ésta absorbe su energía, se electa un electrón de la superficie de la muestra a consecuencia de la radiación emitida. Este electrón emitido se conoce como electrón secundario.

Objetos opacos: Podemos obtener muestras con metales pesados (wolframio, níquel) con muchos electrones, y tienen gran capacidad de eyectar esos electrones del microscopio. Son aquellas zonas de la muestra muy electrondensas. Normalmente se trata de zonas con metales pesados. En estas zonas, al llegar la onda (electrón), esta es absorbida, disminuyendo su amplitud, y creando distorsiones en las zonas colindantes. Por ello, generan sombras nítidas, e imágenes con mucho contraste.

: 1.- Tinción negativa: El mayor problema para estudiar la estructura de macromoléculas mediante microscopía electrónica es que va a haber muy poco contraste de fase. Para salvar este problema es habitual utilizar la tinción negativa, en la que se va a teñir todo excepto la estructura objeto de estudio.

Proceso: a) Partimos de la muestra colocada en una rejilla de cobre de 3-4mm. b) Se le aplica una disolución acuosa tamponada a la muestra. c) Se añade una disolución de sal de metal pesado (electrodenso). d) Así se genera una solución salina del metal pesado, que es muy electrodensa, con las muestras inmersas. El metal rodea la muestra, acumulándose a su alrededor, pero no sobre ella. Así, en principio, la imagen de transmisión debería permitirnos observar la muestra frente a la sombra del metal. Esta disolución dispersa bien los electrones (la muestra no los dispersa), por lo que se forma un negativo de la molécula que estamos observando (fondo teñido con el metal y la muestra sin color) e) Así, la muestra se deshidrata, pero queda inmersa en una capa de metal que la protege de la radiación electrónica y del vacío. Problemas: - Puede se que no empape bien, por lo que hay una parte de la muestra que no se pude visualizar. Si la muestra tiene ciertas zonas por las que no se pueda empapar, no se podrá ver. - El metal pesado (como el Hg) puede estar afectando a la proteína (distorsiona la imagen), haciendo que no se veala verdadera imagen tal y como es.

2.- Criomicroscopía electrónica y contraste de fase: La muestra se incluye en un medio hidrofílico que la preserva del vacío y de la radiación electrónica y que, además, no limita la resolución final. Puede realizarse en una disolución de azúcares o en hielo.

Inclusión de la muestra: 1.- En disolución de azúcares (como glucosa, trehalosa,…). Tienen propiedades de rotación óptica y mejoran el contraste debido a la mayor opacidad de la muestra. Es un método no muy utilizado actualmente. La velocidad de la luz en la muestra depende de esto mismo. Por eso, al ser la muestra más opaca se obtiene un mayor contraste. Bacteriorrodopsina, tubulina,… 2.- En hielo vítreo. Una técnica más actual es congelar la muestra de modo ultrarrápido, de forma que no se pueden formar los cristales de hielo provenientes del agua,pero en presencia de un agente vitrificante, para que los cristales de hielo no destrocen la muestra. Se pone la muestra sobre la rejilla y se sumerge en etano líquido, congelándola inmediatamente. En cada poro de la rejilla se queda un menisco con la muestra. Se visualiza la imagen sin tinción, directamente. Problemas: el problema de esta técnica es el contraste (diferencia con el fondo) es muy bajo. Se ven mal ya que se trata de objetos translúcidos, que no generan una sombra real. Lo que se observa es debido al cambio de fase de la luz, por diferencias en la constante ódieléctrica.

Especímenes ordenados: cristales en 2D En algunos casos hay muestras biológicas que se encuentran en membranas. Las membranas tienen una ventaja, que si la enriquecemos con proteínas podemos conseguir un cristal 2D, ya que las proteínas tienden a colocarse en un mismo plano, el de la membrana. Ej: Lactosa permeasa, ATP-sintasa, etc. Objetos translúcidos: cambios de fase La velocidad de la onda plana incidente se ve influida por la constante dieléctrica. Cambia ligeramente la constante dieléctrica y por lo tanto lo que está pasando por ahí (agua, aire), lo que provoca un cambio de fase de la onda. No cambia la intensidad, no hay sombra. Los objetos traslúcidos presentan por tanto un bajo contraste, ya que no hay sombra, y lo que se observa no es debido a que absorban electrones, sino por distorsiones de las ondas con el cambio de fase. Contraste: Hay técnicas en microscopía para poder elegir la fase. Nos permite seleccionar o favorecer las ondas que no han cambiado de fase o que están en una misma fase. Se selecciona las ondas que han cambiado de fase o contra-seleccionar las que no han cambiado de fase. Esto se realiza en la microscopía electrónica cambiando la apertura; es similar a lo que se hace con el macro y micro del microscopio óptico. Se genera si: • Algunos electrones dispersados por la muestra se eliminan cerrando la apertura. • Aberraciones esféricas. • La imagen no está enfocada, es decir, el plano de la imagen no es el conjugado del plano del objeto. .

Aberraciones: Astigmatismo, aberración cromática, … Deben ser eliminadas para poder obtener una imagen con mayor calidad.

Contraste y desenfoque: Cambiando la apertura para modificar el enfoque, hace que se modifique el contraste. Se modifica el enfoque porque se introduce una pequeña modificación de la fase que tienen los electrones. Seleccionando las fases que se modifican se puede dejar la fase de la muestra intacta y variar el resto para poder observar con mayor nitidez la muestra. Función de dispersión puntual y enfoque: La imagen que vemos es una convolución de la PSF (función de dispersión de punto) y del objeto real. A partir de la imagen borrosa también podemos obtener la función que la emborrona. Para eliminar la función de dispersión de puntos se hacen las transformadas de Fourier, siguiendo el teorema de convolución. La función de transf...