Fécondation part 2 - Cours de manuel mark L1Sps PDF

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Cours de manuel mark
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Service de Biologie de la Reproduction

FECONDATION ET COMMENCEMENT DU DEVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE (Deuxième partie)

Pr. Manuel MARK Faculté de Médecine et Hôpitaux Universitaires de Strasbourg

DE LA FIXATION SUR LA ZONE PELLUCIDE À LA FUSION

Cellule folliculeuse

Centrosome Zone pellucide

Noyau

Granule cortical

Membrane plasmique de l’ovocyte Acrosome Cytoplasme ovulaire

VI. ACTIVATION DE L’OVOCYTE

A un double but : 1. provoquer le "réveil" du métabolisme ovocytaire. 2. s’opposer à la polyspermie; Comporte, dans l'ordre chronologique : 1. une mobilisation du calcium intracellulaire; 2. l‘exocytose des granules corticaux; 3. l'achèvement de la 2e division de la méiose.

VI. 1. MOBILISATION DU CALCIUM INTRACELLULAIRE 500 µm

1 sec before fertilization

10 sec after fertilization Point of sperm entry

20 sec

30 sec

Spreading wave of calcium ions

Propagation d’une vague de libérations d’ions Ca++ à partir du point d’entrée du spermatozoïde démontrée grâce à une molécule qui émet de la lumière après couplage au Ca++

VI. 1. MOBILISATION DU CALCIUM INTRACELLULAIRE Le signal Ca2+ est indispensable pour l’activation de l’ovocyte: - son inhibition bloque l’activation de l’ovocyte

Cytosol

fécondé (cf. action de l’EGTA = ethylene glycol tetraacetic acid); - son induction artificielle provoque tous les événements observés lors de l’activation (cf. action des ions Ca2+ exogènes)

Réticulum endoplasmique lisse (REL)

VI. 1. MOBILISATION DU CALCIUM INTRACELLULAIRE Fusion du spz avec la membrane de l’ovocyte

Ca2+ Ca2+

Ca2+

Ca2+

Introduction de de la phospholipase C (PLC) spécifique du spermatozoïde (PLC zeta) Hydrolyse du phosphatidylinositol diphosphate membranaire (PIP2) Libération d’inositol triphosphate (IP3). Liaison de l’IP3 à ses récepteurs . Ouverture des canaux calciques du REL

Effets cellulaires: - Exocytose des granules corticaux, - Reprise de la méiose - Déclanchement de l’ontogenèse

Cascade de phosphorylations protéiques

Augmentation du signal calcique cytosolique Modification structurale de la calmoduline Activation de protéines kinases

Ca2+

VI. 1. MOBILISATION DU CALCIUM INTRACELLULAIRE

La phospholipase C zeta présente dans le cytoplasme du spermatozoïde est introduite dans le cytoplasme de l’ovocyte au moment de la fusion des membranes. (Nomikos, M., Swann, K., & Lai, F. A. (2012). Starting a new life: Sperm PLC‐‐zeta mobilizes the Ca2+ signal that induces egg activation and embryo development. Bioessays, 34: 126-134.)

VI. 2. EXOCYTOSE DES GRANULES CORTICAUX

Ca2+

VI. 2. EXOCYTOSE DES GRANULES CORTICAUX Spermatozoïde fécondant

Membrane plasmique de l’ovocyte Granule cortical  Inaptitude de la ZP à fixer de Spermatozoïde fécondant Zone pellucide Espace périvitellin

nouveaux spz.

 « Imperméabilisation », « durcissement » de la ZP.

Spermatozoïde refoulé Blocage de la polyspermie (en Zone pellucide complément de la perte de Juno) partiellement dégradée

VI. 2. EXOCYTOSE DES GRANULES CORTICAUX

Ca2+

VI. 2. EXOCYTOSE DES GRANULES CORTICAUX

VI. 2. EXOCYTOSE DES GRANULES CORTICAUX Granule cortical

Membrane plasmique de l’ovocyte

1er globule polaire

Fuseau métaphasique de 2è division méiotique

Espace périvitellin Zone pellucide Spermatozoïde refoulé

VI. 3. ACHEVEMENT DE LA 2e DIVISION MEIOTIQUE

Chromosomes du 2e globule polaire (23,X)

Chromosomes de l’ovotide (23,X)

Conséquences: - élimination de 23 chromosomes; - conservation de la masse cytoplasmique dans l’ovocyte (appelé aussi ovotide à ce stade de sa maturation )

Noyau du spermatozoïde en voie de décondensation

QUELS MECANISMES MOLECULAIRES SOUS-TENDENT LA REPRISE DE LA MEIOSE ? Elévation du calcium dans le cytosol

Ubiquitinylation de la sécurine

Activation du complexe APC (Anaphase Promoting Complex) Complexe multiprotéique ayant une activité ubiquitine-ligase

Dégradation de la sécurine par les enzymes du protéasome

Ubiquitine

Ubiquitine -ligase protéine

Ubiquitinylation de la cycline B

Dégradation de la cycline B par les enzymes du protéasome

L’ ubiquitine = petite protéine (76 aa) dont la liaison covalente à d’autres protéines induit (généralement) leur dégradation au niveau du

Protéasome

protéasome (= un complexe multienzymatique)

Elévation du calcium Activation du complexe enzymatique APC (Anaphase Promoting Complex) = activité ubiquitine - ligase Ubiquitinylation de la protéine sécurine Dégradation de la sécurine par les enzymes du protéasome

1. La sécurine inhibait une protéase, la séparase, au sein d’un complexe sécurine-séparase. 2. Destruction de la sécurine : la séparase dégrade les cohésines qui

Activation de la séparase

maintenaient la cohésion des chromatides sœurs.

Dégradation des cohésines

3. Séparation des chromatides Transition métaphase

anaphase

Cohésines

Elévation du calcium Activation du complexe APC (Anaphase Promoting Complex) = activité ubiquitine - ligase

Le MPF (facteur de maturation = facteur de la mitose) est un hétérodimère formé:

Ubiquitinylation de la cycline B Dégradation de la cycline B par les enzymes du protéasome

- d’une sous-unité catalytique, protéine kinase, la Cdk1 (= protéine kinase-cycline dépendante 1); - d’une sous-unité régulatrice, la cycline B.

Inactivation du complexe MPF (= complexe Cdk1/cycline B)

Sortie de la mitose

VII. FORMATION DES PRONOYAUX

Chromosomes du 2e globule polaire (23,X)

Chromosomes de l’ovotide (23,X)

Noyau du spermatozoïde en voie de décondensation: protamines histones

VII. FORMATION DES PRONOYAUX

T = + 6h

Cortex ovulaire

ADN X2

ADN X2

La réplication de l'ADN nécessaire à la première division de segmentation a lieu simultanément dans les deux pronoyaux, avant leur migration vers le centre de l’ovotide.

L’évolution des pronuclei est synchrone et débute dans le cortex ovulaire

Pronoyau mâle

VIII. CARYOGAMIE = CONTACT DES PRONOYAUX

T = + 12h Prophases: - condensation de 23 chromosomes; - disparition des enveloppes nucléaires

VIII. CARYOGAMIE = CONTACT DES PRONOYAUX

Cytoplasme de l’ovotide Pronucléus féminin Globules polaires Pronucléus mâle Zone pellucide

Contact des pronoyaux vu au microscope à contraste de phase

IX. DEBUT DU DEVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE

Fuseau mitotique

T = + 30h

édifié à partir du seul centrosome

Regroupement des 23 chromosomes

(qui s’est dupliqué)

paternels et des 23 chromosomes maternels dans un plan = métaphase de la 1ère division de segmentation

Ovocyte fécondé (= zygote) en métaphase de première division de segmentation = temps 0 du développement embryonnaire

ANOMALIES DE LA FECONDATION: LEURS CONSEQUENCES SUR L’EMBRYON

1.Triploïdie (3n) - Dispermie - (Digynie = anomalie de la méiose) Les embryons triploïdes ne sont pas viables chez les mammifères et avortent spontanément. Les triploïdies sont à l’origine d’une proportion d'avortements spontanés précoces (= survenant au cours du 1er trimestre) dans l'espèce humaine. Représentation schématique du caryotype d’un embryon humain triploïde : 69, XXX, 69, XYY ou 69, XXY

*Environ 15% des avortements spontanés de cause chromosomique

ANOMALIES DE LA FECONDATION: LEURS CONSEQUENCES SUR L’EMBRYON 2. Chimère chromosomique par double fécondation de l’ovotide et de son globule polaire (ex: hermaphrodite vrai) ovocytes Chimère chromosomique = coexistence chez

un

cellulaires

individu de

de

2

caryotypes

populations différents,

dérivant chacune d’un zygote différent.

Tubes séminifères

Histologie de la gonade d’un hermaphrodite vrai

ANOMALIES DE LA FECONDATION: LEURS CONSEQUENCES SUR L’EMBRYON 3. Androgenèse et môle hydatiforme complète existe chez les humains

- Phénomène de développement à partir du seul noyau mâle: en l'absence d’une régulation le zygote sera haploïde. - L'haploïdie ne permet pas le développement embryonnaire chez les mammifères. - L’androgenèse (dans l'espèce humaine) conduit à la formation d'une tumeur trophoblastique (= tumeur placentaire) ne comportant ni amnios, ni formations embryonnaires, la môle hydatiforme complète. Môle hydatiforme complète: villosités placentaires présentant un aspect kystique caractéristique.

- Caryotype: généralement 46,XX et ADN uniquement paternel.

ANOMALIES DE LA FECONDATION: LEURS CONSEQUENCES SUR L’EMBRYON 4. Parthénogenèse et kyste dermoïde de l’ovaire (ou tératome ovarien) - Processus de développement « embryonnaire » sans fécondation préalable, donc à partir du seul noyau féminin. - Auto-activation de l’ovocyte dans un follicule mûr. - Aboutit à une tumeur ovarienne. - Un kyste dermoïde peut contenir des tissus différenciés provenant de chacun des 3 feuillets primitifs de l’embryon. - 46,XX; ADN uniquement maternel?

Kystes dermoïdes de l’ ovaire contenant peau, poils, ongles, dents, tissu thyroïdien, os, cartilages, épithéliums de type respiratoire (https://secure.health.utas.edu)

CONSEQUENCES PHYSIOLOGIQUES DE LA FECONDATION

1. Rétablissement du nombre diploïde de chromosomes 2. Brassage des caractères héréditaires de l’espèce. 3. Détermination du sexe génétique. 4. Déclenchement de l’ontogenèse. 5. Transmission de l’empreinte génomique parentale.

CONSEQUENCES DE LA FECONDATION RÉTABLISSEMENT DU NOMBRE DIPLOÏDE DE CHROMOSOMES - Spermatozoïde: haploïde (n = 23)

Zygote: diploïde (2n = 46)

- Ovocyte mature (ovotide) : haploïde (n = 23)

Diploïde (2n = 46)

Fécondation

Haploïde (n=23)

CONSEQUENCES DE LA FECONDATION BRASSAGE DES CARACTÈRES HÉRÉDITAIRES DE L’ESPÈCE

(En complément de la méiose): le zygote possède une combinaison de gènes

Diploïde (2n = 46)

Méiose Fécondation

Haploïde (n=23)

.

CONSEQUENCES DE LA FECONDATION

DÉTERMINATION DU SEXE GÉNÉTIQUE

 Mâle hétérogamétique: - androspermatozoïdes (23,Y) - gynospermatozoïdes (23,X)  Femelle homogamétique : 23,X.

CONSEQUENCES DE LA FECONDATION DÉCLENCHEMENT DE L’ONTOGENÈSE

Activation de l’ovocyte

1ere division de segmentation

CONSEQUENCES DE LA FECONDATION

TRANSMISSION DE L’EMPREINTE PARENTALE

INTRODUCTION  1 gène

2 allèles

nous avons dans chaque cellule 2 copies de

chaque gène autosomique: l'une héritée de notre mère et l'autre de notre père.  Pour la plupart (~99%) des gènes, les deux copies s'expriment de la même manière.  Pour un petit nombre de gènes, une seule des 2 copies est exprimée, l'autre est réprimée (= inactive), selon son origine parentale.

Représentation schématique des 2 allèles Paire de chromosomes homologues

d’un gène. Ceux-ci occupent les même sites (= loci) sur les 2 chromosomes

INTRODUCTION

Les gènes qui, au fil des générations, conservent la mémoire de leur origine parentale possèdent une «empreinte génomique parentale» ou « empreinte parentale » = une « étiquette» (appelée « marque épigénétique ») attestant de leur origine paternelle ou maternelle. MISE EN EVIDENCE DE L’EMPREINTE PARENTALE: DEMONSTRATION DE LA NON EQUIVALENCE DES GENOMES PARENTAUX

1. Androgenèse et parthénogenèse expérimentales chez la souris 2. Phénotypes des conceptions uniparentales chez l’Homme 3. Phénotype des conception triploïdes chez l’Homme

Androgenèse et parthénogenèse expérimentales chez la souris Œuf fécondé normal Globule polaire

Ovocyte donneur

Pronuclei Zone pellucide

2. Transplantation nucléaire 1. Enucléation Ovocyte receveur

Il est possible de fabriquer par transplantation de noyaux chez la souris des embryons comportant un génome diploïde totalement uniparental et comprenant: - soit 2 pronoyaux mâles; (= embryons androgénétiques) - soit 2 pronoyaux femelles (= embryons parthénogénétiques).

Androgenèse et parthénogenèse expérimentales chez la souris Technique

Prélèvement. FP; pronoyau féminin; MP, pronoyau masculin. On distingue les pronoyaux par le degré de condensation de la chromatine - On prélève des œufs fécondés dans l'oviducte; - On enlève, à l'aide d'une micropipette, soit le pronoyau mâle, soit le pronoyau femelle ; - On le remplace par un pronoyau du sexe opposé; - On implante les embryons androgénétiques ou parthénogénétiques, au stade de quelq blastomères, dans l'utérus d'une femelle hormonalement préparée (femelle « pseudo-gesta

)

Androgenèse et parthénogenèse expérimentales chez la souris Normal

Parthénogen.

Androgen.

- Zygote androgénétique: produit du trophoblaste, peu de tissu embryonnaire. - Zygote parthénogénétique: produit un embryon, très peu de trophoblaste. Embryons Trophoblaste

L’empreinte génomique parentale a été découverte par McGrath et Solder au début des années 1980

Androgénèse et parthénogénèse expérimentales chez la souris

Les produits des conceptions parthénogénétiques et androgénétiques sont

in utero

La présence simultanée des génomes maternel et paternel est indispensable au développement de l'embryon, car ces génomes ne sont pas équivalents, mais complémentaires Denise P. Barlow, and Marisa S. Bartolomei Cold Spring Harb Perspect Biol 2014;6:a018382

MISE EN EVIDENCE DE L’EMPREINTE PARENTALE: DEMONSTRATION DE LA NON EQUIVALENCE DES GENOMES PARENTAUX

1. Androgenèse et parthénogenèse expérimentales chez la souris 2. Phénotypes des conceptions uniparentales chez l’Homme 3. Phénotype des conception triploïdes chez l’Homme

2. Phénotypes des conceptions uniparentales chez l’Homme Androgenèse et môle hydatiforme complète Les conceptions androgénétiques se développent comme des môles hydatiformes complètes, composées de villosités placentaires, mais sans tissus embryonnaires.

Môle hydatiforme complète: aspect kystique des villosités placentaires

2. Phénotypes des conceptions uniparentales chez l’Homme Parthénogenèse et tératome ovarien - Les conceptions parthénogénétiques donnent des kystes dermoïdes de l’ovaire (= tératomes ovariens), composés de tissus bien différenciés, mais désorganisées, sans structures placentaires.

Kyste dermoïde de l ’ovaire ou tératome ovarien: épithéliums glandulaires (thyroïde par exemple), cheveux, os, dents peuvent se retrouver à l'intérieur d’un kyste

3. Phénotype des conceptions triploïdes chez l’Homme  Les embryons triploïdes résultant d’une dispermie présentent un placenta volumineux avec des villosités kystiques (= môle embryonnée, môle hydatiforme partielle)  Les embryons triploïdes résultant d’une digynie présentent un placenta anormalement petit (et sans villosités kystiques)

Môle hydatiforme partielle: le caryotype des cellules placentaires comporte 69 chromosomes, comme celles de l’embryon

CONCLUSION

Schématiquement: -

2 jeux de chromosomes paternels favorisent le développement du placenta. -

2 jeux de chromosomes maternels favorisent le développement des tissus embryonnaires /différenciés . La présence simultanée des génomes maternel et paternel est indispensable au développement harmonieux de l'embryon, car ces génomes ne sont pas équivalents, mais complémentaires: un génome de chaque sexe est indispensable à une descendance viable.

GÈNE SOUMIS À L’EMPREINTE PARENTALE La non-équivalence des génomes parentaux repose sur l’existence de gènes (autosomiques) soumis à une empreinte parentale.

Lorsqu’un gène est soumis à empreinte, un seul de ses allèles est exprimé (= l’un de ses allèles est réprimé)

expression monoallélique normale du gène à partir, soit

de l’allèle paternel, soit de l’allèle maternel. Les gènes porteurs d’une empreinte paternelle(/maternelle) sont physiologiquement inactifs sur le chromosome (sur l’allèle) d’origine paternel(/maternel) Les gènes soumis à empreinte sont en petit nombre (~ 200 des 20.000-25.000 gènes du génome humain). Ex: le gène codant pour le facteur de croissance IGF2 (Insulin Growth Factor 2). Seul l’allèle paternel (= hérité par le père) est actif.

EXEMPLE DE GÈNE SOUMIS À L’EMPREINTE PARENTALE Le gène codant pour IGF2 (insulin-like growth factor2) : un ex. de gène soumis à empreinte  Igf2 KO (mutation nulle, délétion, de Igf2,

)

transmise par la femelle: les descendants hétérozygotes sont de taille normale; Allèle Igf2 normal exprimé

Allèle Igf2 mutant non-exprimé

 Igf2 KO transmise par le mâle, les descendants hétérozygotes:  sont

Allèle Igf2 mutant non-exprimé

Allèle Igf2 normal non-exprimé

 ont un

à celui de souris

homozygotes pour Igf2 KO.

Invalidation de Igf2 chez la souris (vers 1990)

POURQUOI ?

- Chez les hétérozygotes pour Igf2 KO sur le chromosome d’origine paternelle, le chromoso d’origine maternelle ne compense la délétion.

EXEMPLE DE GÈNE SOUMIS À L’EMPREINTE PARENTALE Le gène codant pour IGF2 (insulin-like growth factor2) : un exemple de gène soumis à empreinte Syndrome de Beckwith-Wiedemann Résulte d’une expression bi-allélique du gène Igf2 Pour que le développement embryonnaire se déroule normalement un seul allèle de Igf2 doit être actif A retenir : l’expression bi-allélique d’un gène soumis à empreinte peut avoir des conséquences dramatiques sur le développement embryonnaire

Syndrome polymalformatif: croissance fœtale excessive du fœtus (hypertrophie des organes (viscéromégalie), omphalocèle, prédisposition à développer certaines tumeurs)

NATURE ET BASE MOLÉCULAIRE DE L'EMPREINTE PARENTALE - Repose sur une modification épigénétique de la chromatine [= soit une modification de l’ADN (ex: méthylation sur des cytosines), soit une modification post-traductionnelle d’histones (ex: acétylation, méthylation, phosphorylation)] qui modifie l’expression des gènes, sans changer dans la séquence des nucléotides de l’ADN. Elle se transmet éventuellement d’une génération de cellule somatique à la suivante.

Chromatine = association ADN + histones

NATURE ET BASE MOLÉCULAIRE DE L'EMPREINTE PARENTALE : LA MÉTHYLATION DE L'ADN La modification épigénétique en

un nucléosome méthyltransférase

ADN méthylé

de l’ADN

rapport avec l'empreinte parentale est la méthylation de l'ADN: - concerne les cytosines dans des doublets (= dinucléotides) CpG ;

Chromatine dans un état condensé ADN non méthylé

- catalysée par des méthyltransférases de l’ADN ; -

une compaction des

nucléosomes, empêchant l'accès transcription

Chromatine dans un état « ouvert »

des facteurs de tr...