Fundamentos de cromatografía PDF

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Fundamentos de cromatografía. 1. ¿Qué es la cromatografía? La cromatografía es una técnica capaz de separar los analitos presentes en una muestra basándose en la diferente velocidad de desplazamiento de estos al ser arrastrados por una fase móvil a través de una fase estacionaria (lecho cromatográfico). La separación tiene lugar como consecuencia de la interacción (equilibrios) entre los analitos presentes en la fase móvil y la fase estacionaria. Las diferentes técnicas se basan en las propiedades físicas o físico-químicas de los analitos: solubilidad, adsorción, volatilidad, tamaño, carga, reactividad química… Se puede emplear para la identificación cualitativa y cuantitativa de las especies separadas. En general, todas las técnicas cromatográficas tienen en común: -Fase estacionaria: líquido o sólido -Fase móvil: gas, líquido, fluido supercrítico. -Una muestra cuyos componentes presentan mayor o menor afinidad por cada una de ambas fases.

2. Clasificación de procesos cromatográficos. Los procesos cromatográficos se pueden clasificar en base a dos criterios: -Atendiendo a la forma de llevar a cabo el proceso cromatográfico, es decir, la forma en las que las fases estacionaria y móvil se ponen en contacto (en columna o plana). -Fundamento del proceso cromatográfico: tipos de cromatografías (según la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase móvil). Es decir, el tipo de fase móvil y estacionaria, y clase de equilibrios implicados en la transferencia de solutos en las fases (gases, líquidos, o fluido supercríticos)Fase estacionaria 1. Fase estacionaria sólida  Cromatografía de adsorción: el sólido (fase estacionaria) adsorbe el componente que inicialmente estaba en las fase móvil o gas, mediante fuerzas de Van der Waals.  Cromatografía de intercambio iónico: el sólido (fase estacionaria) es un intercambiador de iones.  Cromatografía de exclusión molecular: el sólido (fase estacionaria) es un gel formado por polímeros no iónico porosos que retienen a las moléculas de soluto según su tamaño.  Cromatografía de afinidad: el sólido tiene enlazados ligandos de afinidad como son los inhibidores enzimáticos, anticuerpos, etc. 2. Fase estacionaria líquida  Cromatografía de partición: la fase estacionaria es un líquido soportado sobre un sólido soporte inerte.

Fase móvil 1.Fase móvil liquida: -Cromatografía líquido-líquido: tanto la fase estacionaria como la fase móvil son líquidos y por tanto se trata de una cromatografía de partición. -Cromatografía líquido-sólido: la fase estacionaria es un sólido y la fase móvil un líquido, por tanto, puede tratarse de cromatografía de adsorción, intercambio iónico, exclusión o afinidad. 2.Fase móvil gas: -Cromatografía gas-sólido: la fase móvil es un gas y la fase estacionaria un sólido, por tanto, es una cromatografía de adsorción. -Cromatografía gas-líquido: la fase móvil es un gas y la fase estacionaria un líquido, por tanto, es una cromatografía de partición. 3. Fase móvil fluido supercrítico.

3. Parámetros y ecuaciones de interés en cromatografía. -Tiempo de retención (tR): tiempo que tarda cada componente en llegar al detector desde que fue inyectado. -Tiempo de retención corregido (tR’ = tR - t0): tiempo de retención de un componente menos el de la otra especie que no haya sido retenida (en CG suele ser el aire). -Volumen de retención (VR): volumen de fase móvil que debe ser eluido para que un cierto componente salga de la columna. -Resolución (R): es un parámetro que indica la medida en que se han separado dos componentes eluidos consecutivamente.

4. ¿Qué es un cromatograma? Es un gráfico que se obtiene cuando se coloca, al final de la columna, un detector que responde a la presencia de un analito, cuya representación se realiza en función del tiempo (o volumen de la fase móvil añadido). Al aumentar la polaridad, es decir, al aumentar la cantidad de agua respecto a la cantidad de eluyente se obtienen picos más diferenciados en el cromatograma. De ahí, la importancia de elegir un buen eluyente.

5.Desarrollo por elución En el caso ideal, los solutos presentes en la muestra se encuentran separados al llegar al final de la columna. En el cromatograma se verá la banda correspondiente a cada uno de ellos. Experimentalmente se comprueba que cuanto mayor es la longitud de la columna:

 

mayor es la distancia entre los centros de las bandas de los diferentes componentes de la muestra. mayor es la anchura de las bandas correspondientes a los diferentes analitos. El ensanchamiento de las bandas es inevitable, pero es un proceso más lento que el de la separación, lo que posibilita la obtención de buenas separaciones si la columna es suficientemente larga.

Las teorías útiles (teoría de los platos o modelo de equilibrio, o modelo dinámico) para describir el proceso cromatográfico deben ser capaces de explicar:  

la velocidad de migración de los solutos. la velocidad de ensanchamiento de las bandas, dado que la separación entre los componentes depende de ambos fenómenos.

5.1. Teoría de platos o modelo de equilibrio. Se basa en suponer que la fase estacionaria está compuesta por N segmentos imaginarios (platos teóricos), en cada uno de los cuales se alcanza el equilibrio entre la fase móvil y la fase estacionaria. En equilibrios cortos bastará con contacto corto por lo que lo que da lugar a un segmento pequeño y un aumento del número de platos teóricos (N). Las bandas cromatográficas son muy similares a las curvas gaussianas. Consecuencia de la suma de los movimientos al azar de millones de partículas en la banda cromatográfica. Una partícula solo avanza cuando permanece en la fase móvil, y como el tiempo de permanencia puede variar de unas partículas a otras, no salen todas las de un mismo soluto a la vez (banda) En general, el número de platos teóricos (N) en una columna es suficientemente alto como para que todas las bandas muestres una distribución gaussiana. Si N es suficientemente alto y las bandas muestras una distribución gaussiana, la anchura de cada una de ellas será función de la desviación estándar Anchura de la banda = f ( σ t )

5.2. Teoría cinética o modelo dinámico. -Una partícula de soluto sufre durante su migración por el interior de la columna un gran número de transferencias entre la fase estacionaria y la fase móvil. -Se produce una distribución de velocidades alrededor del valor medio que da lugar a una banda que será tanto más ancha cuanto más se desplace el soluto por la columna. -El ancho de la banda (W) será proporcional al tiempo de residencia de la columna, e inversamente proporcional a la velocidad con que se desplaza la fase móvil.

6.Factores que influyen en el ensanchamiento de las bandas La magnitud básica de medida del ensanchamiento de banda es la varianza (� 2) El ensanchamiento de la banda puede expresarse como suma de los incrementos de H producidos por diversos factores.

6.1. Difusión de remolino Este proceso es consecuencia de la existencia de diferentes trayectorias por las que puede pasar la fase móvil a través del empaquetamiento de la columna. La contribución al ensanchamiento de banda, es directamente proporcional: tamaño de partícula, a la geometría empaquetamiento de la fase estacionaria.

al

La contribución de Hglobal es independiente de la velocidad de flujo de la fase móvil. El ensanchamiento de banda disminuye si se trabaja con columnas rellenas con partículas pequeñas y bien empaquetadas que eviten la formación de canales de flujo preferencial.

6.2. Difusión longitudinal. Este proceso es consecuencia de la migración de las moléculas desde la posición central más concentrada de una banda hacia las regiones más diluidas a ambos lados de ella. Puede tener lugar tanto en la fase móvil como en la estacionaria.  

HL es proporcional al coeficiente de difusión molecular del soluto en la fase móvil DM. Si la fase estacionaria es líquida hay que tener en cuenta otro término similar que es proporcional coeficiente de difusión de los solutos en la fase estaciona Ds

Si la fase estacionaria es líquida, se produce una contribución considerable al ensanchamiento de las bandas. En cromatografía de gases el término HL contribuye mucho más al valor de Hglobal que en cromatografía líquida porque el valor D M es unas 10.000 veces mayor que para los gases.

6.3. Resistencia a la transferencia de masa En general, la fase móvil se mueve más rápido de lo necesario para que se alcance el equilibrio. -En el frente de la banda de soluto.



El soluto se transporta un poco más rápido de lo esperado si se alcanzara el equilibrio. No permanece retenido en la fase estacionaria todo el tiempo que debería.

-En la cola de la banda de soluto. 

El soluto se encuentra en la fase móvil más diluido de lo esperado y más concentrado en la fase estacionaria.

Los efectos de resistencia a la transferencia de masa fuera del equilibrio disminuyen a medida que disminuye la velocidad de flujo.

7.Ecuación de Van Deemter 7.1. Determinación experimental de los parámetros de la ecuación de Van Deemter. 7.1.1. Observaciones -CG: proporciona resultados que se ajustan razonablemente bien a los datos experimentales. -CL: resulta necesario introducir modificaciones que afectan a los términos de difusión y transferencia de masa.  Difusión. -Hay que tener en cuenta la difusión tanto en la fase móvil (LM) como en la estacionaria (LS). -Las contribuciones de ambos procesos son similares porque DM y DS son semejantes. -La fase móvil (HLM = ensanchamiento debido a la difusión fase móvil) depende de D M (coeficiente de difusión de solutos en la fase móvil). -La fase estacionaria (HLS = ensanchamiento debido a la difusión fase estacionaria) depende de DS (coeficiente de difusión de solutos en la fase estacionaria).  Resistencia a la transferencia de masa. -En cromatografía de gases, si la fase estacionaria es un líquido y la fase móvil es un gas entonces DM > DS. Por tanto, este término sería despreciable. -En cromatografía de líquido ambos términos proporcionan igual magnitud. Por tanto, DM no es tan elevado por lo que HT es mayor. Problema: surge una ecuación de Van Deemter con mayor complejidad. -Hay que considerar que la fase móvil estancada en los poros de la estacionaria aumenta la resistencia.

7.2. Ecuación de Van Deemter generalizada.

-En cromatografía de gases, la difusión longitudinal sí tiene importancia hasta una velocidad más alta. -En cromatografía de líquidos, la difusión longitudinal apenas tiene importancia a velocidades convenientemente altas. -La velocidad óptima es mayor en cromatografía de gases que en cromatografía de líquidos. -En cromatografía de líquidos, la velocidad óptima es pequeña y al aumentar su valor se produce un ensanchamiento de las bandas.  En cromatografía de líquidos se debe cromatografiar a una velocidad más lenta para obtener un ensanchamiento de banda pequeño. Además, como la pendiente es más acusada en cuanto nos separamos de la velocidad óptima, se produce que el ensanchamiento de bandas es muy importante.  Trabajar a la velocidad óptima (siendo ésta una velocidad muy pequeña) implica tiempos de elución muy altos. Por tanto, nos interesa trabajar a velocidad más altas sin ensanchar tanto las bandas. De esta forma, se consigue disminuir la pendiente ya que varios términos de la ecuación de Van Deemter dependen del diámetro de partícula de la columna de relleno, por eso si disminuye dicho factor también los sumatorios serán menores. Este hecho nos permite a trabajar a velocidades más altas sin apenas ensanchamiento de bandas (HLPC).

8. Resolución. La resolución es un aspecto termodinámico que tiene en cuenta la eficacia y la selectividad. Se utiliza con el fin de que cada compuesto sea retenido de forma diferentes por la columna. Esta resolución tiene que ver con 2 aspectos de la cromatografía: -Aspecto cinético (eficacia): relacionado con la velocidad y altura equivalente de un plato teórico (H y uóptima) lo que proporciona un ancho de banda. Cuanto más pequeño sea el ancho de banda más eficaz es la resolución. -Aspecto termodinámico (selectividad): relacionado con el equilibrio (t R = tiempo de retención) entre los solutos y la fase móvil y los solutos y la fase estacionaria. Siendo el tiempo de retención es propio de cada compuesto.

¿Cómo mejorar la separación entre bandas? Cuando existen 2 picos solapados en un cromatograma se puede mejorar la separación de las bandas, de manera que consigamos ejercer un efecto sobre la columna o sobre la fase móvil eligiendo ambas de manera que los compuestos se retengan de forma más diferenciada por esa columna. También se puede mejorar la separación de las bandas aunque los centros activos de las bandas sean los mismos, es decir, la retención es la misma pero si trabajos a una

velocidad conveniente se puede hacer las bandas sean más estrechas, por lo que la separación es mejor. El método ideal implica que las bandas se separen totalmente pero influyen 2 aspectos: (1). Ancho de las bandas. (2) Separación de las partes máximas de la banda (picos)

8.2. Efecto de la resolución en el tiempo de retención. Tanto la resolución como el tiempo de retención dependen de tres factores: -Eficacia: ( eficacia.

√N

, H): las columnas con tamaño de partícula muy pequeño mejoran la

-Selectividad (α) que depende de las propiedades de los solutos. Por ejemplo: cambiando la química de la fase móvil, es decir, intercambiar metanol por otro compuesto distinto. -Factor de capacidad (K’): depende de los solutos y de la columna. Por ejemplo: si la fase móvil es metanol – agua 80:20, se pueden obtener resultados óptimos variando la proporción de componentes en la fase móvil en 50:50.

8.3. Optimización de la resolución. La resolución puede optimizarse modificando: -El factor de eficacia (K’): se consigue cambiando la relación de disolventes que constituyen la fase móvil. -Selectividad: cambiando el disolvente se consigue cambiar la química de la fase móvil. -Eficacia: buscando el flujo óptimo, reduciendo el tamaño de partículas ( y por tanto, aumenta el número de pisos teóricos) o aumentando la longitud de la columna ( y por tanto, aumenta el número de pisos teóricos). 6.4. Efecto de la selectividad, el factor de capacidad y la eficacia sobre la resolución de picos. -Aumenta el factor de capacidad (K’): obtenemos picos mejor resueltos. -Aumenta el número de pisos teóricos (N): picos mejor resueltos porque disminuye el ancho de banda. -Aumenta la eficacia (α): aumentando o disminuyendo la retención de uno de los componentes, así obtenemos centros de bandas más diferenciados.

8.3.1. Relación entre eficacia y altura de pico. Un aumento en la eficacia (N) da lugar a picos más altos y estrechos, es decir, picos que inicialmente están solapados pueden llegar a separarse. La eficacia depende de: -Longitud de la columna (si aumenta la longitud, aumenta el número de pisos teóricos y aumenta también el tiempo de residencia). -Caudal de la fase móvil (optimizando la velocidad, disminuye la altura de pisos teóricos). -Tamaño de la partícula o grosor de la película de la fase estacionaria (si disminuye el diámetro de partícula, disminuye la altura de pisos teóricos). -Viscosidad de la fase móvil (si disminuye la eficacia, aumenta el coefiiente de difusión de solutos y disminuye la altura de pisos teóricos).

8.3.2. Variación del factor de capacidad. Si representamos Rs y tR frente a K’B obtenemos que: - K’B ha de ser lo más alta posible para tener una buena resolución y, además, cuanto mayor es K’B mayor es tR. En el caso de que existan muchos componentes se fija un eluyente con el objetivo de que K’B se encuentre en el rango de valores 1-10. Cuanto mayor es K’B del compuesto también aumenta el tiempo de residencia, es decir, no va a mejorar en exceso la resolución obtenida. Al optimizar el factor de capacidad se obtiene: -Con una relación etanol-agua 70:30, obtenemos en el cromatograma toda la muestra junta sin picos diferenciados. -Con una relación etanol-agua 60:40, empiezan a separarse todos los compuestos. -Con una relación etanol-agua 50:50, observamos el cromatograma completo ya que se separan todos los componentes. Es decir, en menos de 10 minutos se obtiene el cromatograma completo con picos separados. -Si continúa disminuyendo la cantidad de etanol, se consigue un cromatograma mejorado en cuanto a la resolución. Se mejora la resolución, pero incrementa el tiempo de elución. El factor de capacidad puede optimizarse: -Variando la temperatura en CG (si aumenta la temperatura, disminuye el factor de capacidad). -Variando la composición de la fase móvil en CL. 8.3.3. Variación del factor de selectividad. -Si α = 1 no se obtienen mejoras significativas al intentar optimizar K’ y N. -Por tanto, α es distinto de 1 ya que, de lo contrario, las constantes de distribución son iguales, es decir, los componentes son igualmente retenidos por la fase estacionaria por lo que van a avanzar a la misma velocidad y salen por la columna al mismo tiempo. El factor de selectividad puede aumentar: -Modificando la naturaleza de la fase móvil (cambiar metanol por acetonitrilo, modificando el pH). -Variando la naturaleza de la fase estacionaria (cambiando la columna). -Utilizando alguna especie que forme complejos o interactúe con el analito y modifique K. -Variando la temperatura de la columna (no afectan mucho al factor de selectividad en CG ni en CL pero sí en intercambio iónico).

9. Análisis cualitativo. La cromatografía sirve para identificar y cuantificar compuestos. Resulta una técnica eficaz para cuantificar compuestos, pero menos eficiente para identificar. Es más seguro utilizar el factor de selectividad (α) que el tiempo de retención (t R) para identificar componentes de una muestra, ya que el tiempo de retención está sometido a una variabilidad que depende de la temperatura, por lo que es posible que el eluyente de la fase móvil empleada haya variado su composición. ¿Qué es un patrón interno? Es un compuesto añadido a la muestra que tiene un tiempo de retención similar al compuesto o compuestos a identificar pero que no está solapado con ninguno de ellos. Para identificar compuestos se debe dopar la muestra para comprobar el componente. Si ese pico aumenta de altura indica que corresponde al componente identificado.

9.1. Identificación de los componentes de una muestra. Se identifican los componentes de una muestra mediante distintas estrategias: (1). Detectores selectivos: existen detectores que son selectivos para determinadas sustancias y que pueden ser utilizados para identificar componentes. (2) Sistemas híbridos: utilizan dos técnicas distintas:  

Se utilizan técnicas de identificación muy potentes acopladas a la separación cromatográfica de los componentes de una muestra Se utilizan técnicas desde el punto de vista de la identificación de componentes combinando CG o CL con espectrometría de masas o técnica de infrarrojos.

Utilizando sistemas híbridos obtenemos resultados óptimos que utilizando técnicas por separado. -Con CL o CG pueden separarse los componentes de una muestra en sustancias puras, pero es costosa su identificación. -El espectrómetro de masas funciona correctamente, pero si en lugar de introducirle 1 compuesto se introduce una muestra de distintos compuestos entonces no es posible identificar los componentes. En cambio, si al espectrómetro de masas le entra a cada tiempo un componente distinto y separado, éste proporciona el espectro de masas de cada sustancia pura e identifica cada componente. Por tanto, a partir del área del pico cromatográfico se puede conocer la cantidad de cada sustancia.

10. Análisis cuantitativo. La determinación cuantitativa se basa en establecer relaciones entre los parámetros obtenidos en el cromatograma para un analito (área y altura de pico) y la cantidad a la que corresponde. Condiciones para el análisis cuantitativo. -El detector debe proporcionar una respuesta lineal con la cantidad de analito.

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