Fuzje protoplastów. Embriogeneza somatyczna. PDF

Preview

Summary

Metody kultur in vitro 11. Fuzje Embriogeneza somatyczna. 1. Otrzymywanie i zastosowania kultur fuzyjnych GMO (ang. genetically modified organism) organizm, genom zmodyfikowany w nie jest do w naturalny. Obecnie istnieje bardzo wiele technik otrzymywania genetycznie modyfikowanych, a z nich jest: fu...

Description

Metody kultur in vitro Wykład 11. Fuzje protoplastów. Embriogeneza somatyczna. 1. Otrzymywanie i zastosowania kultur fuzyjnych protoplastów. GMO (ang. genetically modified organism) – organizm, którego genom został zmodyfikowany w sposób, który nie jest możliwy do osiągnięcia w sposób naturalny. Obecnie istnieje bardzo wiele technik otrzymywania organizmów genetycznie modyfikowanych, a jedną z nich jest: • fuzja protoplastów – najstarsza metoda modyfikacji genetycznej roślin pozwalająca na uzyskanie osobników o nowych cechach, a wyprowadzenie funkcjonalnych roślin jest możliwe między innymi dzięki embriogenezie somatycznej. Technika polegająca na izolacji i połączeniu protoplastów (aktywnych komórek bez ściany komórkowej) dwóch blisko spokrewnionych ze sobą roślin rodzicielskich, jednak nie mogących naturalnie się ze sobą krzyżować (muszą mieć również podobną liczbę chromosomów np. grusza i jabłoń): o potomek nosi cechy jednego i drugiego rodzica w skutek połączenia genomów roślin rodzicielskich: § nektarynka – pierwszy udany produkt fuzji protoplastów brzoskwini i śliwy (smak dziedziczony po brzoskwini, skórka owocu po śliwie); § zapewniona obecność chloroplastów i mitochondriów co jest niezwykle ważne, ponieważ część genów kodujących procesy metaboliczne znajduje się w plastydach, a część w jądrach; o wynik komplikowany przez: § niepłodność roślin pochodzących z fuzyjnych protoplastów, w przypadku których mogą się rozwinąć kwiaty i owoce, ale brak obserwowanego kiełkowania nasion. Materiałem wyjściowym do przeprowadzenia fuzji protoplastów są najczęściej tkanki liścia, z których łatwo pozyskać komórki (w trakcie obróbki mechanicznej dochodzi do uszkodzenia tkanek i komórek, dlatego materiał powinien być wytrzymały na całkowite zniszczenie, ale jednocześnie dość delikatny), a te inkubuje się w roztworach celulaz i enzymów rozpuszczających ściany komórkowe. Następnie przeprowadza się kilkugodzinne wirowania w różnych gradientach, prowadzące do uzyskania aktywnych metabolicznie komórek roślinnych otoczonych wyłącznie błoną komórkową. W ciągu 24h należy przeprowadzić hybrydyzację somatyczną ze względu na fakt, że żywe komórki pozbawione ścian komórkowych zaczynają je odtwarzać, co prowadzi do tworzenia mikrociał 1 i wytwarzania kalusa. Metoda fuzji protoplastów została opracowana po to, aby po raz pierwszy przekroczyć granicę niekrzyżowalności pierwotnie u zbóż i zwiększyć ich ploidalność (obecnie większość zbóż zawiera wiele genomów w swoich komórkach, brak jest odmian 2n). Jest to więc alternatywna technika produkowania allopoliploidów. Izolacja i hodowla protoplastów pozwalają więc na: • bezpośrednie wprowadzanie obcego DNA – zastosowanie mające znaczenie dla gatunków, które nie poddają się transformacji z zastosowaniem wektorów Agrobacterium, ale także dla badań ekspresji krótkotrwałej; • tworzenie hybryd somatycznych – otrzymywanie roślin potomnych w wyniku skrzyżowania dwóch organizmów rodzicielskich należących do różnych taksonów. Dwoma sztandarowymi przykładami hybryd są rodzaje słabo krzyżujące się między sobą: o cytrusy, w przypadku których fuzja protoplastów mandarynek i grejpfrutów dała pomelo (Citrus maxima); 1

mikrociała – agregaty komórek otaczających się wspólną ścianą komórkową.

o ziemniaki – w obrębie tego rodzaju problem stanowi fakt, że duża część odmian jest podatna na choroby ziemniaka, a także na niekorzystne warunki środowiska. Fuzja protoplastów gatunków dzikich, bardziej odpornych (np. z Peru) z odmianami hodowlanymi pozwoliła na zaniechanie masowego oprysku środkami ochronnymi: § problemem w tym przypadku była różnica w ploidalności ziemniaka dzikiego (4n) i uprawnego (2n), dlatego przed fuzją należało przekształcić psiankę dziką w podwójnego haploida; § krzyżowanie Solanum chacoense i odmiany Solanum tuberosum pozwoliło na uzyskanie odmiany o wysokich walorach smakowych i odporności na PMV. 2. Protokół izolacji i hodowli protoplastów. W celu wyizolowania protoplastów z całej rośliny, należy z jej hodowli wybrać odpowiedni organ (najczęściej liść), odciąć i przepłukać wodą destylowaną. Następnie materiał należy osuszyć, podzielić na fragmenty i usunąć spodnią epidermę w warunkach sterylnych. Tak przygotowane części umieszcza się na powierzchnię roztworu pożywki mineralnej z 13% mannitolem i pozostawić na 30 minut w celu zajścia procesu plazmolizy komórek: • mannitol – alkohol cukrowy powodujący obkurczanie protoplastów i całkowitą plazmolizę, która jest wymagana, ponieważ chroni zawartość komórki przed następnym etapem, w którym traktuje się ją celulazami. Całkowicie skurczenie i oderwanie od ściany protoplastu powoduje, że tylko ściana komórkowa jest traktowana enzymami trawiennymi (zawartość komórki | błona komórkowa | bufor | ściana komórkowa | enzymy hydrolityczne). Po tym czasie należy usunąć roztwór plazmolizujący i zastąpić go mieszaniną zawierającą celulazy i macerazy. W wyniku degradacji ściany komórkowej protoplast przyjmuje kształt kulisty, a materiał jest następnie oceniany mikroskopem świetlnym.

Rysunek 1. i 2. Mikroskopowe obrazy przedstawiające przyjmowanie kształtu kulistego przez protoplasty w wyniku degradacji ściany komórkowej.

Tak otrzymane protoplasty wymagają od kilku do kilkudziesięciu godzin inkubacji w roztworze (czas ten należy ustalić doświadczalnie). Probówkę przeznaczoną do wirowania wypełnić do 1/3 wysokości 25% roztworem sacharozy, a na jego górną warstwę przenieść protoplasty w roztworze enzymów do wytworzenia dwóch wyraźnych warstw. Wirować przy wartości g nie większej niż 800 ze względu na fakt, że komórki mogą nie przeżyć. Do pipety z tipsem i

szerokim zakończeniu pobrać zawiesinę formującą cienką, intensywnie zieloną warstwę bezpośrednio nad powierzchnią sacharozy.

Rysunek 3. i 4. Probówka z zawiesiną protoplastów po wirowaniu oraz obraz mikroskopowy zwirowanej frakcji komórek (widoczne uszkodzenia wielu z nich wskutek działania dużej siły ciężkości).

Zawiesinę umieścić w probówce i dodać 2x większą objętość 13% mannitolu, następnie zwirować przy wartości g równej 500 co spowoduje, że nieuszkodzone, żywe protoplasty utworzą osad na dnie probówki. Zawartość przemyć kilkukrotnie wyżej wymienionym cukrem i zawiesić w płynnej pożywce MS z 9% (0,05 M) mannitolem: • ponieważ związek nie jest pobierany przez komórki roślinne, przez co potencjał osmotyczny pozostaje niezmienny – nie następuje de- lub plazmoliza, co obserwuje się w przypadku sacharozy. W kolejnym etapie należy przeprowadzić mikroskopową ocenę jakości izolacji w celu oznaczenia gęstości, która umożliwi rozcieńczenie zawiesiny protoplastów do gęstości 1 x 105 protoplastów na mililitr i wprowadzić do hodowli prowadzonych na szalkach lub płytkach. Jest to najbardziej odpowiedni moment na przeprowadzenie fuzji protoplastów 2. W przypadku pozostawienia protoplastów w hodowli dojdzie do uformowania ścian komórkowych (tylko komórki, które utworzą ścianę będą w stanie się podzielić) i wytworzenia kalusa, którego efektywność wzrostu jest bardzo zmienna: • PE (ang.planting efficiency) – ilość kolonii dzielących się w stosunku do ilości żywych protoplastów. Po dwóch tygodniach od założenia tworzą się wielokomórkowe kolonie a po kolejnych 2-3 tygodniach makroskopowe zbiorowiska mogą zostać przeniesione na podłoże stałe. Regeneracja roślin obejmuje kontrolowany przyrost tkanki kalusowej na podłożu z auksyną i cytokininą lub przez androgenezę pośrednią czy embriogenezę somatyczną. W trakcie hodowli protoplastów stosuje się: • podłoża płynne – w małej skali często stosuje się „siedzące” lub wiszące krople; • podłoża półpłynne – zawierające połowę dawki agarozy i rozlewane na szalkę Petriego przed jej zastygnięciem: o w przypadku hodowli protoplastów nie stosuję się zwykłych, stałych pożywek agarowych ze względu na fakt, że agar zestala się w temperaturze 41-43°C co doprowadza do śmierci komórek (można korzystać z agarozy, która ma o wiele niższą temperaturę zestalania); 2

ze względu na fakt, że od razu po wprowadzeniu do hodowli protoplasty zaczynają formowanie nowej ściany komórkowej, a proces ten trwa od 2-7 dni (ocena mikroskopowa komórek pozwala na określenie na jakim etapie jest ten proces, ponieważ komórki będą w jego trakcie tracić sferyczny kształt).

•

•

•

otoczkowanie w alginianie sodu – gdzie zawiesinę protoplastów w alginianie wkrapla się do roztworu chlorku wapnia, a w wyniku reakcji powstaje nierozpuszczalny w wodzie alginian wapnia tworzący wokół protoplastów warstwę żelu. Po wytworzeniu ściany komórkowej żel jest usuwany przez dodatek cytrynianu, a metoda ta eliminuje stres termiczny podczas hodowli; komórki wspomagające: o do hodowli protoplastów dodaje się „zwykłe” komórki, które wydzielają do podłoża metabolity wtórne i pierwotne; o komórki te są przed wprowadzeniem uszkadzane przez napromieniowanie i tworzą warstwę odżywiającą, na którą nawarstwia się protoplasty; o inną metodą jest oddzielanie komórek wspomagających od protoplastów membraną nylonową; pożywki kondycjonowane.

3. Fuzja protoplastów. Fuzja protoplastów jest procesem, który nie zawsze daje potomstwo o równej zawartości materiału genetycznego komórek rodzicielskich. Często zdarza się tak, że w momencie różnicowania dochodzi do degradacji któregoś z jąder komórkowych lub organelli, co skutkuje powstaniem cybryd, a nie hybryd. Nierówne dzielenie w fuzji chloroplastów ujawnia się z pokolenia na pokolenie, co widać przez zanikanie cech jednej z komórek rodzicielskich na rzecz drugiej. W wyniku fuzji mogą powstawać: • organizmy typu rodzicielskiego – powstają z komórek, które nie uległy fuzji; • homokariony – produkt fuzji dwóch jednakowych protoplastów; • heterokariony – produkty fuzji niejednakowych protoplastów.

Rysunek 5. Schemat możliwości przebiegu fuzji protoplastów.

Istnieje metod zainicjowania fuzji komórek protoplazmatycznych: • elektrofuzja – protoplasty są szeregowane w komorze pod wpływem impulsu elektrycznego tworzą kanały między błonami sąsiednich komórek (jeśli sygnał elektryczny jest zbyt mały to nie następuje połączenie, jeśli zbyt duży, to nastąpi połączenie zbyt wielu komórek ze sobą); • fuzje PEG – protoplasty pokrywa się warstwą glikolu polietylenowego (poli(tlenku etylenu)) i inkubuje razem: w momencie styku błon komórkowych następuje wytworzenie kanałów między komórkami.

Po fuzji powstałe komórki zaczynają się zaokrąglać, wytwarzać ścianę komórkową i dzielić.

Rysunek 6. Fuzja komórek protoplazmatycznych.

Do identyfikacji fuzji protoplastów również można zastosować szereg technik: • selekcja komplementarna – możliwa w przypadku, gdy komórki macierzyste posiadają charakterystyczną cechę (marker) np. odporność na antybiotyk czy herbicyd. Roślina zregenerowana po fuzji powinna mieć cechy obydwu rodziców; • segregacja komórek na podstawie znaczników fluorescencyjnych – komórki macierzyste znakuje się różnymi fluorochromami 3, a produkt uzyskanej fuzji zawiera obydwa fluorochromy; • segregacja mechaniczna – mikroskopowa metoda uznaniowa często sprawdzająca się, gdy komórki wyjściowe różnią się morfologicznie: o w przypadku różnicy w wielkości protoplastów można wykorzystać cytometr przepływowy; • hodowla masowa – nie przeprowadza się selekcji wstępnej, zamiast tego pozwala się na regenerację wszystkich produktów fuzji i dopiero później dokonuje się oceny pod kątem przydatnych cech.

Rysunek 7. Segregacja fluorescencyjna protoplastów fuzyjnych. Widoczny udany produkt fuzji dwóch różnych matczynych protoplastów (heterokarion).

4. Embriogeneza somatyczna. Embriogeneza somatyczna (SE) – proces uzyskiwania zarodków z tkanek somatycznych. Dotychczasowe badania na modelach zwierzęcych nie udowodniły możliwości przeprowadzenia tego rodzaju embriogenezy, jednak w przypadku roślin jest to możliwe, a metody stosowane do tego procesu są bardzo wydajne. Podczas embriogenezy z komórek wegetatywnych następuje indukcja podobnych procesów metabolicznych i rozwojowych, które mają miejsce w komórkach generatywnych. Embriony są regenerowane bezpośrednio z 3

nie można jedynie korzystać z fluorochromów dających czerwony sygnał, ponieważ w świetle UV chlorofil również fluoryzuje na kolor czerwony.

diploidalnej tkanki somatycznej de novo lub pośrednio przez tkankę kalusową. W procesie tym embriony tworzą się jako struktury dwubiegunowe, a nie jednobiegunowe i wywodzą się z pojedynczej komórki oraz nie mają połączenia z tkankami proembriogennymi. Indukcja procesu SE wymaga jedynie auksynowego sygnału hormonalnego, podczas gdy w procesie organogenezy konieczne są sygnały auksynowe i cytokininowe. Podczas embriogenezy równocześnie formuje się pęd i korzeń zarodkowy, natomiast w organogenezie indukcja tworzenia obu tych struktur przebiega osobno. Czynnikami wpływającymi na embriogenezę somatyczną są: • aspekty genetyczne (m.in. organizacja DNA); • genotyp; • rodzaj lub typ rośliny (np. zielne, drzewiaste itp.) • wiek i stadium rozwojowe eksplantatu; • stan fizjologiczny tkanki eksplantatu; • czynniki zewnętrzne (skład podłoża, temperatura, światło) SE może zachodzić na dwa sposoby: • embriogeneza bezpośrednia – gdy embrion powstaje bezpośrednio z tkanki eksplantata, w których znajdują się komórki zdeterminowane proembriogennie (PEDC, ang. pro-embryogenic determined cells). Takie komórki znajdują się w tkankach zalążni, pylnikach, hipokotylu i obielmie; • embriogeneza pośrednia – gdy z tkanki eksplantatu indukowany jest kalus, a z jego komórek embriony roślinne. Takie embriony powstają z komórek indukowanych do stanu proembriogennego (IEDC, ang. induced embryogenic determined cells). U niektórych roślin embriogeneza somatyczna może zachodzić w dowolnej tkance (np. u marchwi), jednak u większości są to tylko wybrane obszary, przy czym kwiaty, obszary pręcików i słupka są bardzo dobrym materiałem do indukcji (do której zawsze konieczny jest dodatek auksyn). Dodatkowymi substancjami indukującymi SE są L-glutamina (obowiązkowa) oraz węgiel aktywowany (niewymagany), który powoduje obniżenie stężenia kwasu fenylooctowego oraz benzoesowego, czyli naturalnych inhibitorów embriogenezy somatycznej. Rozwój embrionów zachodzi wyłącznie przy początkowej obecności auksyn, które następnie muszą zostać usunięte z podłoża, a stadia rozwoju są analogiczne jak w czasie formowania embrionów zygotycznych: • globularne; • sercowe; • torpedy; • kotyledonu; • dojrzałe.

Rysunek 8. i 9. Etapy rozwoju embrionów somatycznych i zygotycznych.

Dojrzewanie embrionów wymaga całkowitego uformowania łącznie z merystemem wierzchołkowym, korzeniem zarodkowym i liścieniami. W tym czasie produkowane są białka stanowiące materiał zapasowy, a zakończenie dojrzewania związane jest ze wzrostem stężenia ABA, który jest konieczny do prawidłowego uformowania embrionu (odpowiada m.in. za

desykację i spoczynek). Kiełkowanie zachodzi wyłącznie u 3-5% zarodków, które często wymagają dodatkowej suplementacji cukrami. W przypadku roślin drzewiastych oprócz suplementacji należy osuszyć oraz ochłodzić zarodki.

Rysunek 10. Pośrednia embriogeneza somatyczna Crocus heuffelianus.

Embriogeneza somatyczna ma praktyczne zastosowanie w tworzeniu sztucznych nasion, czyli produktów mających swoje początki w latach 70. (Murashige) złożonych z somatycznego zarodka zamkniętego w żelowej (alginianowej 4) kapsule, zdolnego do regeneracji całej rośliny. Obecnie są to też układy złożone z zaczątku rośliny: zarodków somatycznych, paków wierzchołkowych czy korzeni zarodkowych. Sztuczne nasiona są nowoczesnym sposobem rozmnażania rzadkich i trudnych w uprawie roślin (np. w masowej produkcji rzadkich roślin iglastych). Metoda ta nie sprawdziła się jednak jako alternatywa dla nasion w przypadku upraw roślin rolniczych (np. zbóż).

4

stosowany jest alginian ponieważ nie wchodzi w reakcje chemiczne z roślinami....