Informe Ensayo Cometa PDF

Preview

Summary

Download Informe Ensayo Cometa PDF

Description

ENSAYO COMETA EVALUANDO GENOTOXICIDAD EN TOMATE. Jhon Jairo López y Yirley Mireya Morales Curso de Genética Molecular, Grupo A. Departamento de Ciencias Agrarias, Universidad de Pamplona.

Resumen El tomate es uno de los vegetales más consumidos, es consumido es crudo lo que conlleva a la ingesta de residuos químicos presentes en la superficie del vegetal, es uno de los cultivo a los que se le realiza mayor manejo con productos químicos debido a la gran susceptibilidad que presenta ante enfermedades ocasionadas por patógenas y plagas; muchos de los plaguicidas utilizados para el manejo de los cultivos están clasificados cono cancerígenos según la Organización Mundial de la Salud debido a las alteraciones que causa en el material genético, para identificar este tipo de alteraciones se utiliza el ensayo cometa. Para medir la genotoxicidad del tomate se utilizaron extractos del mismo en diferentes concentraciones sobre células sanguíneas y por medio de electroforesis se observó los fragmentos de ADN que migraron, por medio de la investigación se identificó que el tomate contiene residuos químicos causantes de genotoxicidad, este efecto aumenta cuando e aumenta la concentración del extracto. Palabras clave: Genotoxicidad, alteraciones, plaguicidas, ADN, ensayo cometa.

Abstract. Tomato is one of the most consumed vegetables, it is consumed raw, which leads to the intake of chemical residues present on the surface of the vegetable, it is one of the crops that is handled more with chemical products due to the great its susceptibility to diseases

caused by pathogens and pests; Many of the pesticides used for the management of crops are classified as carcinogenic according to the World Health Organization due to the alterations it causes in the genetic material, to identify this type of alterations the comet test is used. To measure tomato genotoxicity, extracts of it were used in different concentrations on blood cells and through electrophoresis the DNA fragments that migrated, through research it was identified that the tomato contains chemical residues that cause genotoxicity, this effect increases when e increases the concentration of the extract. Keywords: Genotoxicity, alterations, pesticides, DNA, comet assay.

INTRODUCCION El bioensayo es una técnica que

ampliada, y permite ahora, detectar con alta sensibilidad una gran variedad de

prueba el daño del material genético

daños del ácido desoxirribonucleico en

causado por diferentes agentes químicos y

cualquier tipo de células.

físicos. Rodríguez & García (2016)

El primer acercamiento a esta

afirman que: el ensayo Cometa, o

técnica ocurrió en 1970 cuando Piter

electroforesis alcalina de células

Cook y colaboradores desarrollaron una

individuales, se ha convertido en un

técnica para investigar la estructura

método simple, rápido y económico. El

nuclear basada en la lisis de las células

cual se basa en la visualización

con detergentes no iónicos y cloruro de

microscópica de las imágenes del ácido

sodio a alta molaridad. Rydberg y

desoxirribonucleico después que las

Johanson introdujeron el uso de la

células son embebidas en agarosa, lisadas

electroforesis, utilizando células de

y sometidas a una electroforesis alcalina.

hámster embebidas en agarosas, las cuales

Esta metodología básica ha sido

después de ser lisadas en un medio

alcalino, las cadenas de Ácido

uso creciente y la inadecuada

Desoxirribonucleico (ADN) eran

manipulación de estas sustancias sobre

visualizadas con naranja de acridina.

dicho cultivo ha despertado inquietudes

Posteriormente este método fue

sobre la integridad de nuestro ADN. Es

modificado por Östling y Johanson en

por ello que se pretende determinar el

1984, quienes fueron los primeros en

potencial de actividad genotóxica en el

desarrollar una técnica de electroforesis

cultivo de tomate mediante el ensayo

en microgeles para detectar el daño al

cometa. El tomate es un producto de alto

ADN a nivel de células individuales.

consumo dentro de la canasta familiar y

(Rodríguez & García, 2016)

muy susceptible a un rango amplio de

La integridad de nuestro ADN es

plagas y enfermedades, lo cual hace que

un aspecto fundamental para la salud y

los agricultores colombianos hagan uso

buen funcionamiento de nuestro

de sustancias químicas para el control de

organismo. El cual se ha visto truncada

estos. Como sustancias químicas

con el inicio de la revolución verde

empleadas en el campo para repeler

(1960), en el cual se estableció una

algunas plagas y enfermedades se

dinámica diferente de producción y por

evidencia la utilización de Trifluralina,

ende cambios en la integridad de los

Glifosato, Paraquat, Benzimidazoles,

alimentos. La necesidad de producir una

categoría toxicológica IV y riesgos de

mayor cantidad y calidad de tomate

generar genotoxicidad en el alimento

(Solanum lycopersicum), mediante el

(FAO, s.f)

control de plagas, trajo como

(MARTINEZ, et al. 2016).

consecuencia el uso intensivo de los

“Los productos químicos

plaguicidas durante los últimos años. El

peligrosos, como los plaguicidas y

herbicidas anteriormente mencionados se

a través de una columna que

pueden clasificar, según estudios

contenía amberlita XAD-2 (15g) a

científicos de sus efectos potenciales para

una velocidad de 15 mL/min.

la salud, en cancerígenos (pueden

5. El material retenido por la

provocar cáncer), neurotóxicos (pueden

amberlita fue eluido con 100 mL

dañar el cerebro) o teratógenos (pueden

de diclorometano. Después de

dañar al feto)” (OMS, 2016), es por ello

obtenido el extracto, se concentró

que se presente analizar los residuos

en un evaporador rotatorio de

genotóxicos que se almacenaran en el

vacío a baja presión (Heidolph

tomate.

modelo Laborota 400-1), hasta la

MATERIALES Y METODOS

sequedad.

1. Inicialmente se macero 120 g de

6. seguidamente se cuantificó el

tomate durante 10 minutos hasta

extracto seco equivalente a los

obtener el jugo

120 gramos iniciales.

2. luego se adiciono 30 mL de acetona

7. El extracto obtenido se dividió en dos partes.

3. posteriormente se centrifugo a

8. La primera parte para los análisis

3500rpm durante 20 minutos.

genotóxicos el cual se diluyó en 3

Después de los cuales se retiro y se almaceno el sobrenadante. Este

ml de dimetil sulfóxido al 1% y 9. La segunda parte restante para el

procedimiento se repite 5 veces.

análisis cromatográfico.

4. Para la concentración del material

Extracción de linfocitos:

presente en el extracto, el

necesario para el experimento de

sobrenadante recolectado se pasó

genotoxicidad, el cual se extrajeron de

una persona joven y sana. Los linfocitos

Cx41) equipado con filtro de 515-560 nm

se separaron de la sangre y para ello se

y un filtro de barrera de 590 nm. Para

uso un gradiente de ficoll-hipaque.

estos resultados se hicieron tres

Seguidamente, se determinó la viabilidad,

experimentos por cada tratamiento y en

la cual siempre se mantuvo por encima

cada uno se contaron 100 células. Como

del 90%.

control negativo se utilizó, el DMSO al

Detección de daño del ADN por el Ensayo Cometa Se trataron alrededor de 40.000

1%, que fue el solvente de las muestras. La ocurrencia de daño en el ADN se determinó mediante el uso del software

células o linfocitos con tres dosis (100μg,

(Tritek Comet ScoreTM freeware v1.5)

200 μg y 300 μg) de extractos de tomate,

basado en las siguientes mediciones:

se incubaron por un periodo de 1 hora a

longitud total del cometa, área del cometa

37°C, las placas se sumergieron 1h en

(µm²), diámetro de la cabeza (µm),

solución de lisis. Las placas se lavaron

%DNA en cabeza, longitud de la cola µm,

con PBS y se colocaron en una unidad de

%DNA en cola.

electroforesis horizontal con un buffer

Resultados.

pH>13 y se incubó por 30 minutos, luego

A continuación se muestran los resultados

se corrió a 25V y 300 mA por 30 minutos.

obtenidos tras el ensayo cometa, donde

Después de la electroforesis, las placas

podemos ver la cantidad de ADN dañado

fueron lavadas con un buffer neutralizante

por el extracto del tomate con residuos de

por 10, luego se tiñeron con 50 μl de

plaguicidas y fungicidas, para el control

Bromuro de etidio (0.02mg/mL). Las

positivo se utilizó peróxido de hidrogeno

observaciones se realizaron en un

el cual daña el material genético y para el

microscopio de fluorescencia (Olympus

control negativo DMSO, como se observa

en la tabla incluso el control negativo

300 μg fue la que más daño provoco en el

tienen daño en el ADN ya que presenta

material genético.

una cola de 5,68 m y porcentaje de ADN en la misma de 2,03. La concentración de Tabla 1 Resultados de ensayo cometa en tomate.

Longitud

Diámetro

% DNA

Longitud

%DNA

Momento Momento

cometa

cabeza

cabeza.

cola (m)

cola

de cola

Olive

Control

( m) 49,4

( m) 44,30

97,97

5,68

2,03

0,10

0,23

negativo Control

105,60

43,026

94,23

62,58

5,76

3,24

2,03

positivo Dosis 1

60,2

39,2

97,2

21,2

2,8

0,5

0,4

(100 μg) Dosis 2

80,1

36,0

95,7

44,1

4,3

1,5

1,0

(200 μg) Dosis 3

140,2

35,6

93,2

106,1

6,8

5,5

3,1

(300 μg)

En la tabla 1 se presentan

observar con el microscopio fluorescente

diferentes tratamientos, en uno de ellos

vamos a obtener fragmentos de ADN que

está el control positivo el cual es un

migraron dando la semejanza a la cola del

tratamiento que por lo general se hace con

cometa, teniendo en cuenta esto

H2O2 que daña la estructura del ADN y

observamos que el control negativo es el

al momento de hacer electroforesis y

que menos porcentaje de ADN tiene en la

cola, la dosis 3 (300 μg) es el tratamiento

ADN presenta en la cola es directamente

con mayor porcentaje de ADN en la cola

proporcional con la dosis empleada, es

y a la vez la cola más larga es decir que el

decir a mayor dosis mayor longitud de la

material genético contenía pequeños

cola del cometa y mayor porcentaje de

fragmentos de ADN capaces de migrar a

ADN presente en la misma, mientras que

una distancia más larga. Las diferencias

es inversamente proporcional al diámetro

en longitud de la cola del tratamiento

de la cabeza del cometa, es decir a mayor

dosis 3 con respecto a las dosis 1 y 2 son

dosis menor es el diámetro de la cabeza.

realmente grandes, con respecto a la dosis

El daño genotoxico aumenta cuando se

1 es 4 veces más larga y 2.5 veces más

aumenta la dosis.

larga que la dos; en cuanto al porcentaje

Tras observar los resultados se puede

de ADN presente en las colas la tabla 1

concluir que el tomate causa

nos muestra que la dosis 3 es la que

genotoxicidad en las células del cuerpo en

contienen mayor cantidad de ADN

altas concentraciones, producto de los

fragmentado el cual se refleja en la cola

residuos químicos que se le aplican al

mientras que la dosis 1 presenta el menor

cultivo durante su ciclo, incluso en

porcentaje (excluyendo el control

poscosecha con el fin de que lleguen en

negativo).

las mejores condiciones a su destino.

El daño ocasionado en las células

El alto uso de productos químicos en los

por el tratamiento dosis 3 es mayor al

cultivos puede conllevar a producir

daño ocasionado por el control positivo el

genotoxicidad y alteraciones en el

cual sabemos que daña el material

material genético de los consumidores.

genético, la longitud y el porcentaje de Referencias

FAO (s.f). Listado de Plaguicidas Usados para el Control de Enfermedades en el Cultivo de Tomate. FAO. http://www.fao.org/3/a1374s/a1374s06.pdf Martinez, L., Valenzuela, C., Waliszewski, S., Menzoza, J., Martinez, T., Kassi, E., Ruiz, G. y Armendariz, B. (2016). Nivel Tecnológico de Invernadero y Riesgo para la Salud de los Jornaleros. Nova Scientia Nº18, volumen 9 21-42. https://pdfs.semanticscholar.org/4c29/d0e1008e9e8b75165f95c7ffdccdb8d14a33.pd f OMS (2016). Residuos de los Plaguicidas en los Alimentos.Organizacion mundial de la slaud. https://www.who.int/features/qa/87/es/#:~:text=Los%20productos%20qu %C3%ADmicos%20peligrosos%2C%20como,(pueden%20da%C3%B1ar%20al %20feto). Rodríguez, A. y García, E. (2016). Principios y relevancia del ensayo cometa. Revista cubana de investigación Biomedica.https://www.medigraphic.com/pdfs/revcubinvbio/cib-2016/cib162g.pdf...