Interações- Antígeno- Anticorpo PDF

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Resumo de imunologia sobre interações antígeno anticorpo....

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P4 IMUNO – AULA 2 - INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO: TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS DE DIAGNÓSTICO - A interação antígeno-anticorpo não envolve reação covalente. Ligação covalente é uma ligação extremamente forte, difícil de romper. - Dependendo da natureza do antígeno (pois pode ser variável) podemos ter uma dessas interações ou mais do que uma dessas: * Pontes de hidrogênio; * Interações eletrostáticas; * Forças de Van der Waals; * Interações hidrofóbicas. Essas ligações são passíveis de dissolução... Ou seja, podemos retirar a interação ag-ac. Interações ag-ac in vitro (células): *Formas de interação que utilizam marcação para serem visualizadas (colorimétricas, radioativas, luminiscentes, etc): - ELISA; Western Blot; Imunohistoquímica; Imunofluorescência; Citometria de Fluxo; Radioimunoensaio; Quimioluminescência. 1. * Metodologias que não envolvem nenhum tipo de marcação; * Formas de interação Ag-AC sem marcação de nenhuma natureza, sendo a visualização um processo físico: - Reações de aglutinação: aglutinação direta e indireta, inibição de aglutinação e teste de coombs. - Reações de precipitação: imunodifusão dupla, imunodifusão radial e imunoeletroforese. Em ambos os casos necessita de uma ligação cruzada de várias moléculas do antígeno com o anticorpo para que se forme o precipitado/agregado para que enxergamos. 1.1) Reações de Precipitação: * Interação ac-ag de natureza solúvel; * Ac precisa ser bivalente; * A reação pode ser afetada pelo número de sítios de ligação que cada Ac possui para seu Ag  Valência - As reações de precipitação envolvem reações de antígenos solúveis com anticorpos IgG e IgM para formar grandes agregados moleculares, as treliças. Ocorrem em dois estados distintos: * os antígenos e os anticorpos rapidamente formam pequenos complexos ag-ac. Ocorre dentro de alguns segundos; * os complexos ag-ac formam treliças que se precipitam em solução. Pode levar minutos ou horas; - Deixar o soro e esperar durante um tempo, ag vão se ligar ao ac e vice-versa, vai formar uma concentração equimolar - vai haver uma zona de equivalência. - Realizados em exames, porém é uma forma muito qualitativa, não dá para fazer contagens ou coisas do tipo. Apenas saber se tem ligação de ag-ac.

Exemplo de precipitação: Triagem inicial para sífilis ou lues: VDRL recipitação: direta clássica Triagem inicial para sífilis: VDRL – se busca no soro do paciente a presença de anticorpos para a cardiolipina. Componente da membrana dos treponemas; Teste barato que ainda hoje é feito; se busca a interação do soro do paciente que tem ac anticardiolipina com a cardiolipina do musculo cardíaco de boi e se identifica a precipitação ou não. 1.2) Reações de aglutinação: O antígeno deve estar particulado. Por exemplo: bactérias que tenham antígenos na sua superfície ou uma hemácia... Antígeno precisa ser uma partícula. - Aglutinação ativa: quando o antígeno naturalmente é uma partícula (hemácia, bactéria, etc). - Aglutinação passiva: quando o antígeno é solúvel e foi ligado a partículas insolúveis e inertes (artificialmente particulado). Alternativamente, o anticorpo pode ser ligado a partículas. Ex: Pérolas de látex são muito utilizadas. São antígenos particulados (insolúveis) + anticorpos; a agregação é visível de partículas! Ex: a agregação de grupos sanguíneos ABO é um exemplo muito clássico de aglutinação ativa. Paciente com grupo sanguíneo A e interage com anti corpo A. Ex: coombs Direto e Indireto no diagnóstico de Eritroblastose Fetal. Pode ser feito com as hemácias do recém-nascido se a mãe tem ac. Na grande maioria para se fazer diagnóstico usa-se o soro do paciente ou o soro do animal imunizado. Esses anticorpos são chamados de policlonais. Anticorpos policlonais: antígeno que usa para imunizar e que tinha inúmeros determinantes antigênicos e então temos ac corpo contra os vários determinantes antigênicos. A sorologia ou busca de anticorpos no soro de pacientes para diagnóstico de doenças sempre se baseia em anticorpos policlonais pois assim é a resposta imune humoral. Anticorpos monoclonais: são ac produzidos por um núcleo de clones de linf B, sendo, idênticos em relação as suas propriedades. Feito um ac para cada epítopo antigênico do antígeno. Esses mAbs podem ser gerados em laboratório para reconhecer e se ligar em qualquer Ag de interesse.

Imunizava-se o camundongo com antígenos que possuem vários determinantes antigênicos  o camundongo respondia fazendo o soro policlonal, respondia contra todos os epítopos antigênicos desde antígeno  retiravase o baço onde tinham bastante linf B ativados  e esses linf B eram fundindos com cels de mieloma  se replicava  célula hibrida  expansão clonal  separava-se ac monoclonais. - Células eram guardadas por anos.

Anticorpos monoclonais humanizados: maioria do seu componente é humanizado, ou seja, há uma melhora na sua imunogenicidade; - é altamente usado na área de oncologia: anticorpos monoclonais específicos para algumas células tumorais. Pode ser feito: * paciente recebe anticorpo que liga na cel tumoral e ligando na cel tumoral atrai por exemplo células NK que são cels que podem matar o tumor por toxicidade... * anticorpo ligado com toxina bacteriana por exemplo, aí ele liga na célula tumoral e essa toxina é internalizada pela célula e mata especificamente. * anticorpo monoclonal ligado no tumor e mata a cel tumoral por radiação– radioterapia: diminuindo efeitos colaterais. * feito para formas de diagnóstico de metástase (tomografia) 2. Formas que já utilizam marcação: 2.1) ELISA – Ensaio de imunoadsorção ligada à enzima (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay); Padrão Ouro (Gold Stardard) para muitos diagnósticos: Princípios: Pesquisa antígeno ou anticorpo. A placa que se utiliza é placa de plástico. O plástico tem propriedades de adsorver proteínas na sua superfície (antígeno ou anticorpos). Proteína se liga no plástico. Ex: se queremos procurar ac colocamos ag no fundo do poço; se queremos procurar ag colocamos anticorpo no fundo do poço. Leitura final é feita pela intensidade de cor “colorimetria”: espectrofotômetro. A ligação de anticorpos aos antígenos pode ser detectada com anticorpos conjugados à enzimas (fosfatase alcalina, peroxidase, β-galactosidase). O anticorpo pode ser ligado (conjugação) a uma enzima. Para revelar a cor temos que fornecer pra essa enzima o substrato dela.. Exemplo: se é uma fosfatase tem que dar um substrato rico em fosfato. A reação da enzima com o substrato leva à oxidação de um cromógeno incolor, que desenvolverá coloração de intensidade proporcional à quantidade de enzima. Quanto mais escura a coloração mais anticorpo tem para interagir.

Pode-se ainda conjugar os anticorpos primários ou secundários com outros compostos para aumentar o sinal da reação. Exemplos: Biotina-Fosfatase alcalina ou Streptoavidina- BiotinaFosfatase alcalina. Aumenta o tamanho do conjugado  amplifica o sinal. Mais usado: H2O2/DAB Anticorpo primário: primeiro anticorpo a interagir com o antígeno. Anticorpos secundários: Estão disponíveis comercialmente: anti-IgG, anti-IgM, anti-IgA, antiIgE. Humanos e animais. Como faz? Exemplo: Purifica-se IgG humana e a mesma é injetada numa cabra e a cabra responde a essa proteína estranha produzindo um anticorpo “anti-IgG humana”, que é posteriormente purificado e conjugado a enzimas, radioisótopos, etc.. Esses anti IgG liga em qualquer IgG humana para qualquer tipo de reação. Esses anti-anticorpos podem ser adquiridos conjugados a enzimas, agentes radioativos, fluorescentes e luminiscentes e são muito empregados nos inúmeros testes imunológicos. Vantagens do uso dos anticorpos secundários: Diminuição de custos; - Anticorpo primário: Ac marcado deve ser específico para cada antígeno. - Anticorpo secundário: único Ac marcado pode ser utilizado para diversos antígenos.

Elisa simples direto: - Envolve-se antígeno e anticorpo!!! - A proteína pode ser utilizada para sensibilizar a placa. Compra-se a placa e fazemos a sensibilização. Coloca-se o antígeno em todos os poços, incuba-se, lava-se. O que ligou no fundo da placa, fica ligada no fundo da placa. Pode-se comprar a placa sensibilizada. Elisa indireto: - O antígeno está sensibilizando a placa. Depois usa-se o anticorpo (soro do paciente) para interagir com esse antígeno. EXEMPLO DE ELISA INDIRETO: Triagem para HIV: • Placa recoberta com proteínas do HIV  Adiciona-se o soro do indivíduo  Adiciona-se anti-IgG humana conjugada a uma enzima  Adiciona-se o substrato para a enzima para leitura Controles positivos, negativos e de conjugado são imprescindíveis. Elisa sanduíche: - Busca de antígeno. Placa sensibilizada com anticorpo!! - Ex: Teste ELISA para diagnóstico de rotavírus. • Placa recoberta com anticorpos anti-Rota Vírus  Adiciona-se suspensão de fezes do indivíduo  Adiciona-se anticorpo anti-RV conjugado a uma enzima  Adiciona-se o substrato para a enzima. 2.2) Western Blots: Eletroforese: proteínas podem ser separadas de acordo com a sua carga. Para o Western Blots as proteínas são separadas de acordo com o peso molecular. Proteínas podem ser desnaturadas com detergente (SDS) e agente redutor ficando com a

mesma carga (-) e serem separadas de acordo com o tamanho molecular SDS/PAGE. Transferência por filtro  o filtro é usado para interagir com o ac. Obs: Epítopos antigênicos conformacionais podem ser perdidos na desnaturação! Para HIV sempre é necessário fazer western blots.. Primeiro ELISA depois WB. Ex: diagnóstico confirmatório HIV! O soro do paciente é incubado com tiras de nitrocelulose contendo antígenos de HIV. A detecção de anticorpos específicos é uma evidência muito forte para a infecção do paciente pelo vírus. 2.3) IMUNOHISTOQUÍMICA: detecção de antígenos em cortes histológicos (Ex: diagnóstico de EBV, HPV). - Cortes histológicos. - Busca-se o antígeno pois o corte histológico é de um determinado paciente. Usa-se anticorpos específicos para determinados vírus. - Utiliza anticorpos conjugados a enzimas e a revelação mostra um precipitado colorido no local da interação do vírus com o anticorpo. - Porém se quiser buscar anticorpo, fixa-se na placa antígeno e coloca o soro do paciente para buscar o anticorpo. 2.4) IMUNOFLUORECÊNCIA - Anticorpos são conjugados (ligados de modo covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiação UV, emite luz no espectro visível. - Necessita-se microscópio de fluorescência. Imunofluorecência direta: Detecta Antígeno. Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos, etc. ETAPAS: Fixação do esfregaço da lâmina (paciente)  Tratamento com anticorpo marcado  Incubação  Lavagem para remover excesso de anticorpos marcados não ligados  Visualização no microscópio de fluorescência. Imunofluorecência indireta: Detecta Anticorpo Detecção de anticorpos no soro do paciente. Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de Chagas, AIDS, hepatites e complexos em doenças auto-imunes. ETAPAS: • Antígeno é previamente fixado na lâmina (kits)  Incubação com o soro do paciente  Lavagem para remover excesso de anticorpos não ligados  Incubação com anticorpo marcado anti-imunoglobulina  Lavagem para remover excesso de anticorpos não ligados  Visualização no microscópio de fluorescência. 2.5) Citometria de Fluxo: - Necessita-se de cels em suspensão. Quando elas estão em suspensão as mesmas são sugadas por uma sonda. Célula é examinada por feixes de luz. - Separação de células marcadas por fluorescência ou populações celulares distintas; - Não necessita de microscópio de fluorescência; - Anticorpos marcados com fluorocromos - Teste qualitativo e quantitativo - cels podem ser separadas por tamanho/complexidade/fluorecencia - Parâmetros considerados básicos que podem ser medidos simultaneamente: - Tamanho celular (FS); - Complexidade das células (SS);

Os feixes podem ter vários comprimentos de onda ao mesmo tempo, portanto, pode-se detectar vários antígenos naquela célula, usando anticorpos com diferentes fluoróforos (cores diferentes). As células previamente coradas com fluorocromos, uma vez excitadas pelo laser, emitem luz de acordo com suas características fluorescentes!!! A luz é espalhada (scatter) de acordo com as características morfológicas e estruturais da célula: ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC): complexidade; ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC): tamanho; APLICAÇÕES: * Determinar o tipo e número de células sanguíneas * Isolar populações celulares * Distribuição de células de acordo com a densidade dos antígenos * Tamanho celular. 2.6) Radioimunoensaio: - Anticorpo com agente radioativo. - Reação de competição por um receptor comum entre uma substância a ser determinada e a mesma marcada radioisotopicamente. - Como radiação é extremamente sensível, esse método é usado para quantidades muito pequenas de ag. Exemplo: • Quantificação (0,0001 micrograma/mL): Hormônios; Proteínas séricas; Drogas; Vitaminas; Anticorpos. • Marcações: Iodo-125 (I125): emite raios gama; Trítio (H3 ): raios beta • Aplicações - Testes que necessitem de alta sensibilidade: Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue; Pesquisa; Pesquisa de drogas na urina ou soro de atletas (“dopping)./ Como acontece? O paciente tem que tem ter anticorpo contra o antígeno S (vacinado). Porém se na triagem vê-se que a pessoa tem anticorpo para outros componentes do vírus além do antígeno S  esse sangue não é usado para doação. Necessita-se saber que o paciente tem o vírus: Busca-se o antígeno de superfície do vírus (ele está presente em quantidades pequenas, portanto é importante fazer radioimunoensaio  qtidades pequenas). Quanto menos radiação tem mais antígeno no paciente!!!! Reação de competição. Antígeno é marcado com radioisótopo  liga no anticorpo que está adsorvido na placa  quando lê-se a radição lê em alta luminosidade, pois só o antígeno marcado na placa. Se ele se liga altamente no soro  alta radiação. Vantagens: Alta sensibilidade e especificidade; Baixo custo; Requer pouca amostra; Rápido. Desvantagens: Instabilidade dos radioisótopos; Risco operacional; Necessidade de medidas especiais; Elevado custo de biossegurança e problemas com o descarte de material. 2.7) Quimiluminescência: Método imunológico baseado na emissão de energia luminosa a partir de uma reação química; - Reação química que desestabiliza emite luz. - Quantifica antígeno ou anticorpo ou testes que necessitem de alta sensibilidade: Hormônios; Drogas; Vitaminas - Opção de ensaio com elevada sensibilidade e especificidade adequada. - Um dos métodos para substituir o radioimunoensaio. - Nessa técnica, o anticorpo secundário é conjugado a uma substância que, quando ativada,

emite luz visível. Então, a emissão de luz (fótons) é proporcional ao Ac/Ag pesquisado.

Exemplo: luminol. Agente que quando interage com H2O2 fica instável e essa instabilidade faz com que emita luz. Exemplo: luciferina  vagalumes. Vantagens da Quimioluminescência: - Elevada sensibilidade - Linearidade da curva dose resposta - Rapidez no sinal gerado e estável - Custo (uso de pequenas quantidades de reagentes) - Procedimento simples CUIDADOS PARA TODOS ESSES TESTES: * É importante bloquear reações inespecíficas. Sempre tem que ter em mente que a cor pode se desenvolver de uma forma não específica  BLOQUEIO DE REAÇÕES INESPECÍFICAS. Bloqueio peroxidases endógenas: peróxido de hidrogênio e azida sódica. Bloqueio biotina endógena: tampões alcalinos, leites desnatados (caseína) ou pré incubação. Primeiro é importante bloquear essas reações para depois fazer a reação de ag-ac. * É importante ter controles (negativo e positivo)...