Jądro komórkowe - biol PDF

Preview

Summary

16.02 II. Morfologia jądra komórkowego Jądro komórkowe oddzielone jest od cytosolu otoczką z dwóch błon. Istnienie takiej bariery pozwala na czasowe i przestrzenne oddzielenie transkrypcji i translacji. Ma to związek z obróbką genów podzielonych u Eucaryota (egzony i introny, czapeczka, poli-A, liga...

Description

16.02.2004

II. Morfologia jądra komórkowego Jądro komórkowe oddzielone jest od cytosolu otoczką z dwóch błon. Istnienie takiej bariery pozwala na czasowe i przestrzenne oddzielenie transkrypcji i translacji. Ma to związek z obróbką genów podzielonych u Eucaryota (egzony i introny, czapeczka, poli-A, ligazy łączą sekwencje kodujące - pomiędzy powstawaniem pre-mRNA a translacją transkrypty muszą być chronione przed dostępem rybosomów). W jądrze do nici DNA nie przyłączają się rybosomy. U Procaryota nie ma potrzeby rozdziału tych procesów, translacja zachodzi często równocześnie z transkrypcją. Oddzielenie jądra kom. od cytozolu  izolacja pierwotnych transkryptów od rybosomów  umożliwia dojrzewania posttranskrypcyjne W kom. prokariotycznych: 1 transkrypt – jeden gen (rRNA) do końca 5’ dołączają się rybosomy – translacja W kom. eukariotycznych: egzony + introny transkrypt pierwotny: pre-rRNA (bez możliwości przyłączania rybosomów) -> dojrzewanie -> wzorzec translacji wycinanie intronów przez endonukleazy; introny ulegają degradacji lub nie egzony powiązane ze sobą przez ... (enzymy) – splicing Wniosek: transkrypcja i translacja – oddzielone przestrzennie i czasowo W komórkach merystematycznych i innych rosnących (dzielących się) jądro komórkowe jest duże. Istnieją komórki dwujądrzaste (bikariocyty, np. hepatocyty) i wielojądrzaste (np. w osteoklastach)



Skład jądra komórkowego: Otoczka jądrowa – Składa się z błony zewnętrznej, która ma łączność z aparatem Golgiego oraz z błony wewnętrznej. Pomiędzy nimi znajduje się przestrzeń perinuklearna. Na błonie zewnętrznej utwierdzone są rybosomy, znajdują się tam także białka enzymatyczne (występujące także w ERg): cytochromy P450 i B5. Błona wewnętrzna zawiera białka LAP (Lamin Associated Proteins): LAP 1A, 1B, 1C, 2, które wiążą błonę otoczki z laminą (blaszką podstawną) – elementem struktury matrix jądrowej. W trakcie profazy otoczka rozpada się na pęcherzyki. W otoczce jądrowej znajdują się pory (jądrowe kompleksy porowe) odpowiedzialne za transport do i z jądra. Ich liczba jest zmienna, zależy od intensywności metabolizmu, a zatem m. in. wieku komórki. Do jądra transportowane są m. in. białka histonowe, czynniki transkrypcyjne, białka budujące rybosomy, natomiast na zewnątrz: mRNA, tRNA i podjednostki rybosomów. Energia do transportu pochodzi z hydrolizy ATP lub GTP. Budowa i działanie poru:

1

Jądrowe kompleksy porowe zakotwiczone są w obydwu błonach otoczki za pośrednictwem integralnych białek błonowych: POM121 i GP210. Pojedynczy por stanowi kompleks zbudowany z białek z grupy glikoprotein nazywanych – ze względu na lokalizację i funkcję – nukleoporynami. (Do tej pory u różnych ogranizmów odkryto ponad 100 różnych nukleoporyn.) Pory posiadają oktamerową symetrię, składają się z trzech pierścieni: wewnętrznego (centralnego, jądrowego – osadzonego w wewnętrznej błonie otoczki), środkowego (pokrywającego się z przestrzenią perinuklearną) i zewnętrznego (cytoplazmatycznego – osadzonego w zewnętrznej błonie otoczki) zbudowanych z nukleoporyn. Pierścień centralny (wewnętrzny) jest zdubowany z tetramerów, pomiedzy którymi znajdują się kanały o średnicy około 10 nm ułożone na kształt ośmiu szprych w kole rowerowym. Tam odbywa się transport bierny (dyfuzja jonów i małocząsteczkowych związków). Natomiast w kanale centralnym o średnicy 20-25 m ma miejsce transport aktywny, do którego niezbędne są białkowe przenośniki. Transportowane cząsteczki mają domeny sygnałowe, podczas transportu następuje rozkład związków wysokoenergetycznych. Dodatkowo pory wzmacniają filamenty. 

Szkielet czyli martix jądrowa – Zapewnia odpowiednie ułożenie chromatyny. Skład matrix:  Lamina (blaszka podstawowa połączona z martix) - białkowa warstwa pod błoną jądrową, połączona z nią za pośrednictwem białek LAP (znajdujących się w otoczce). Jej podstawowym składnikiem są białka laminy, które – za względu na różne zachowanie w stosunku do chromatyny – dzieli się na kilka klas: A, B1, B2, C. Laminy B1 i B2 wchodzą w reakcje z chromatyną, ‘dość stałe’ połączenie. Laminy A i C łączą się z białkami LAP. Laminy zorganizowane są w filamenty pośrednie (u roślin jest to jedyny typ filamentów pośrednich). Mają dwa końce: C-terminalny i NH2terminalny . Pojedynczy filament ma postać dimeru, którego elementy są helikarnie oplecione wokół siebie. Na krańcach znajdują się bardzo istotne sekwencje aminokwasów: sekwencja sygnałowa oraz sekwencje łączące z białkami LAP. Fosforylacja lamin przez MPF powoduje rozpad laminy (blaszki podstawowej), a co za tym idzie – również otoczki.  Siateczka wewnątrzjądrowa – Jest najmniej stabilna i znana, bardzo trudna do wyizolowania. Istnieją formy: włókienkowa i włókienkowogranularna. Część włókienkowa prawdopodobnie tworzy szkielet dla tych odcinków chromatyny, w których ulega ona transkrypcji. Uwaga! Niejasność! W części włókienkowej wykryto enzymy: topoizomerazy i polimerazy 2 (związane z rozluźnioną chromatyną), co może oznaczać, że tu odbywa się replikacja. W części włókienkowo-granularnej znajdują się pierwotne transkrypty pre mRNA (odpowiedzialna za posttranskrypcyjne dojrzewanie mRNA)  Matrix jąderkowa (białkowy szkielet jąderka) – do tej pory odkryto 3 rodzaje białek tu występujących: o B26 – odpowiedzialne za końcowe procesy składania podjednostek rybosomowych o fibrylamina – białko zasadowe, pojawia się tam, gdzie dojrzewają pre mRNA

2

nukleolina – ufosforylowana – osłabia powinowactwo histonu H1 do DNA, występuje w tych rejonach, gdzie zachodzi transkrypcja; nieufosforylowana – jest jedym z białek inicjujacych rozcinanie pierwotnych transkryptów rRNA Funkcje macierzy jądrowej (informacje zbiorcze): -udział w organizacji strukturalnej jądra i tworzeniu konfiguracji przestrzennej chromatyny - rola w procesie replikacji DNA (wieloenzymatyczne kompleksy replikacyjne) - regulacja ekspresji genów - udział w transkrypcji i dojrzewaniu pre rRNA oraz snRNA, a także transporcie prekursorów rybosomów do cytoplazmy - wiązanie hormonów steroidowych - fosforylacja białek wirusowych - wiązanie karcynogenów o

 Chromatyna – Składa się z DNA, histonów (DNA + histony = zrąb jądrowy) oraz ruchliwych elektroforetycznie białek niehistonowych, występuje tu także snDNA (small nuclear DNA, małe jądrowe DNA). 

DNA - Łańcuchy polinukleotydowe skręcone są w prawoskrętną, dwuniciową helisę o średnicy 2nm. Jeden skręt helisy o długości 3,4 nm zawiera 10 par nukleotydów – DNA B. DNA Z – lewoskrętna helisa. DNA A – o największej średnicy. Ze względu na ich liczebność sekwencje DNA dzielą się na:  Unikalne występują w liczbie 2 na genom geny dla białek niehistonowych i białek zapasowych u roślin  Powtarzalne do 105-106 - w DNA bardzo mocno upakowanym (heterochromatyna)  Umiarkowanie powtarzalne 103-105 geny kodujące rRNA, tRNA, histony, ... 

Wysoce powtarzalne – satelitarne, które nie zawierają genów, wchodzą w skład heterochromatyny konstytucyjnej (nie są transkrybowane) Rozproszone i tandemowe (sekwencje powtarzalne występują najczęściej w formie tych ostatnich – tandemowych) - bogate w tyminę i adeninę SAR/MAR – za ich pośrednictwem DNA łączy się z białkami histonowymi matrix jądrowej lub siateczki wewnątrzjądrowej;



Histony – białka zasadowe bogate w Liz (H1, H2A, H2B) i Arg (H3, H4). Ich wypadkowy ładunek jest dodatni (przyciąganie elektrostatyczne z ujemnie naładowanym DNA). Histony są syntetyzowane w fazie S, są konserwatywne ewolucyjnie, najbardziej zmienny jest histon H1. Modyfikacje w strukturze chromatyny (Remodeling chromatyny – zmiany w interakcjach białka – DNA wpływające na konformację chromatyny tak, aby umożliwić lub zahamować ekspresję określonych genów. 2 mechanizmy:

3

1) oparty na acetylacji/deacetylacji (np. metylacja) w rdzeniu nukleosomowym 2) zależny od działania ATP oraz kompleksów białek SWI/SNF Modyfikacje histonów:  Metylacja – przyłączanie grupy metylowej po syntezie histonu. Najczęściej zachodzi metylacja lizyny, rzadziej argininy i histydyny – wpływa na interakcje z DNA – zachodzi podczas replikacji – reakcja nieodwracalna – H3 i H4, które stanowią rusztowanie nukleosomu o Fosforylacja – Najważniejszą rolę odgrywa fosforylacja seroniny i kreoniny w H1. Ma ona związek z kondensacją chromatyny - związek z kondensacją - proces odwracalny - H1, H2A, H3 - H1 w interfazie jest ufosforylowane w niewielkim stopniu o Acetylacja – Przyłączenie reszty kwasu octowego, co powoduje ujemne naładowanie histonów i rozluźnienie struktury nukleosomalnej DNA. Proces ten jest odwracalny i prowadzony przed replikacją i transkrypcją przez acetylotransferazy (acetylotransferazy sprawiają, że proces acetylacji jest odwracalny). - w rdzeniu nukleosomów - odwracalny - związek z replikacja i transkrypcją - superacetylowane histony H3 i H4 w komórkach o wysokiej aktywności transkrypcyjnej - dotyczy reszt Ser i Liz w N-terminalnych końcach histonów - osłabia kontakt histonów z DNA

Upakowanie chromatyny: - nukleosom – histonowy rdzeń z nawiniętym lewoskrętnie DNA (ok. 140 par zasad). Trzonem jest tetramer złożony z H3 i H4. Na obrzeżach znajdują się 2 dimery: H2A i H2B. - włókno nukleosomowe (średnica 11nm) – nukleosomy połączone odcinkami łącznikowymi w szereg, DNA łącznikowe wchodzi w interakcję z H1 (H1 nie występuje w nukleosomie) - włókna chromatynowe (średnica 30nm) – odcinki nieczynne, odpowiedzialne są za nie H1 - Solenoid, supersolenoid (średnica 300nm) – tu już rolę odgrywają białka matrix i oddziaływanie SAR z białkami histonowymi, – na jeden skręt przypada 1-6 nukleosomów - chromosomy metafazowe (średnica 1400nm) – najbardziej skondensowane Podział chromatyny: o Heterochromatyna konstytucyjna o Skondensowana (istnieją różne stopnie kondensacji), nieczynna. o Jej ilość jest genetycznie zdeterminowana. o Zawiera wysoce powtarzalne sekwencje satDNA (satelitarny DNA). o Nie zawiera sekwencji transkrybowanych. o Histony H3, H4 i H2B nie ulegają acetylacji. o Metylacja Lis (lizyny) 9 w histonie H3 blokuje dostęp czynników transkrypcyjnych. o Rekombinacje mejotyczne sporadyczne (rzadko crossing-over).

4

Ten typ chromatyny dekondensuje tylko podczas replikacji (pod koniec fazy S). o Niedostępna dla nukleaz i czynników mutagennych. o Barwi się intensywnie. Euchromatyna o Występuje w różnych stanach kondensacji, głównie solenoidu 30 nm. o Zawiera sekwencje transkrybowane, unikalne. o Replikowana jest podczas całej fazy S. o Dochodzi tu do częstych rekombinacji mejotycznych. o Wzrost acetylacji histonów tam, gdzie aktywna chromatyna. o Obniżona metylacja Lis 9 w histonie H3. o Dostępna dla nukleaz i związków mutagennych. o

o



Jąderko o Nie jest oddzielone od reszty jądra żadna błoną! o Zawiera odcinki DNA kodujące rRNA. o Znajdują się tu białka enzymatyczne, białka budujące przyszłe rybosomy. o Zachodzą tu następujące procesy:  Transkrypcja genów dla rRNA, dojrzewanie  Synteza 3 klas rRNA, różniącego się...  18S rRNA -> mniejsze podjednostki  25S -> większe  5S -> większe ssRNA syntezowane poza jąderkiem (???) Zawiera białkową matrix, geny dla rRNA, nie posiada błony. Tu znajduje się cały aparat służący do produkowania rRNA. W chromosomach jąderkotwórczych (najczęściej jest ich 2) we wtórnych przewężeniach znajduje się DNA kodujące rRNA. Czasem dochodzi do implifikacji (powielenia) genów kodujących rRNA (w komórkach o wzmożonym metabolizmie). W DNA – specyficzne sekwencje SAR/MAR – wchodzą w bezpośrednie i b. trwałe połączenia z laminami .

Elementy strukturalne jąderka (widoczne w mikroskopie elektronowym): - centrum fibrylarne – tu znajdują się te odcinki rDNA, które nie są aktualnie transkrybowane - gęsty składnik fibrylarny (elektronogęsty) – tu działają enzymy, aktywna transkrypcja; znajdują się tu:  rDNA, na których przebiega transkrypcja  transkrypty dla rRNA, które podlegaja dojrzewaniu itd.  Enzymy z tym związane -

składnik granularny – zewnętrze jąderka;  jego ilość jest zmienna, zależy od aktywności metabolicznej jąderka  zawiera podjednostki rybosomów Nie całe RNA powstaje w jąderku: tylko RNA 18s (mała podjednostka), 5,8s i 28s (duże podjednostki). Poza jąderkiem powstaje RNA 5s (należy również do dużej podjednostki)

Typ polimerazy

Miejsce działania

Transkrybowane geny

5

I

jąderko

II

chromatyna

III

chromatyna

18s rRNA 5,8s rRNA 28s rRNA Geny kodujące białka Geny snRNA (small nuclear RNA) występują w spliceosomach, są malutkie, nie wychodzą z jądra tRNA 5s rRNA Geny małych strukturalnych RNA

U roślin zaobserwowano 3 typy jąder (ze względu na wyraźną różnicę między hetero- i euchromatyną): o Retikularne – dobrze odróżnialna chromatyna, tu zalicza się jądra „okapowe” – zawierają chromosomy w konfiguracji Rabbla o Retikularne z chromocentrami – chromocentry tam gdzie niewiele DNA; 2cDNA :2040pg), mają bardzo rozproszoną heterochromatynę o Chromocentryczne – w jądrach z bardzo małą ilością DNA, euchromatyna jest tu bardzo rozproszona i słabo rozróżnialna Ilość DNA nie ma wpływu na rozwój organizmu i jego stanowiska systematycznego. Płeć zależna od chromosomów X (żeński) i Y (męski). Wyjątkiem są m.in. świerszcze (XX-samiec, Xsamiczka). Ciałka Barra (zheterochromatynizowany (zkondensowany) drugi homosom X) – odpowiedzialne są za prawidłowy rozwój samiczki (bardzo wyraźnie się barwią). Co badaliśmy na ćwiczeniach: Do obserwacji morfologii jądra komórkowego wykorzystywaliśmy materiał roślinny z kilku powodów: o max. st. kondensacji o wyraźna różnica między hetero- i euchromatyną Typy morfologiczne jądra komórkowego: o o o o o o o o

Jądro retikularne (siateczkowe). Przekrój przez zalążek krasnokwiatu (Haemanthus sp.). Preparat barwiony hematoksyliną żelazistą. Jądro „okapowe”. Przekrój przez merystem wierzchołkowy korzenia jęczmienia (Hordeum vulgare). Jądro euchromocentryczne. Przekrój prze merystem wierzchołkowy korzenia rzepaku (Brassica napus). Jądro retikularne z chromocentrami. Przekrój przez merystem wierzchołkowy korzenia cebuli. Jąderka w komórkach merystemu wierzchołkowego korzenia cebuli ( Allium cepa). W jąderkach widoczne „wakuole jąderkowe”. Makro i mikronukleus orzęska (Tetrahymena thermophila). Barwnik Giemzy. Jąderka w komórkach merystemu wierzchołkowego korzenia rzepaku (Brassica napus). Widoczna nuleonema. Safranina z zielenią. Heteropyknoza chromosomu X. Przekrój przez cewkę w jądrze owada z rzędu Orthoptera. Widoczne jądra komórkowe w stadium pachytenu podczas spermatogenezy.

6...