KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI DALAM BIDANG FARMASI EFFENDY DE LUX PUTRA PDF

Preview

Summary

KROM ATOGRAFI CAI R KI N ERJA TI N GGI D ALAM BI D AN G FARM ASI EFFEN D Y D E LUX PUTRA Ju r u sa n Fa r m a si Fa k u lt a s D a n I lm u Pe n ge t a h ua n Ala m Un ive r sit a s Sum a t e r a Ut a r a I . PEN D AH ULUAN 1 .1 . Se j a r a h Krom at ografi adalah suat u ist ilah um um yang digunak...

Description

KROM ATOGRAFI CAI R KI N ERJA TI N GGI D ALAM BI D AN G FARM ASI EFFEN D Y D E LUX PUTRA Ju r u sa n Fa r m a si Fa k u lt a s D a n I lm u Pe n ge t a h ua n Ala m Un ive r sit a s Sum a t e r a Ut a r a

I . PEN D AH ULUAN 1 .1 . Se j a r a h Krom at ografi adalah suat u ist ilah um um yang digunakan unt uk berm acam - m acam t eknik pem isahan yang didasarkan at as part isi sam pel diant ara suat u rasa gerak yang bisa berupa gas at aupun cair dan rasa diam yang j uga bisa berupa cairan at aupun suat u padat an. Penem u Krom at ografi adalah Tswet t yang pada t ahun 1903, m encoba m em isahkan pigm en- pigm en dari daun dengan m enggunakan suat u kolom yang berisi kapur ( CaSO4 ) . lst ilah krom at ografi dicipt akan oleh Tswet t unt uk m elukiskan daerah- daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom . Pada wakt u yang ham pir bersam aan, D.T. Day j uga m enggunakan krom at ografi unt uk m em isahkan fraksi- fraksi pet roleum , nam un Tswet t lah yang pert am a diakui sebagai penem u dan yang m enj elaskan t ent ang proses krom at ografi. Penyelidikan t ent ang krom at ografi kendor unt uk beberapa t ahun sam pai digunakan suat u t eknik dalam bent uk krom at ografi padat an cair ( LSC) . Kem udian pada akhir t ahun 1930 an dan perm ulaan t ahun 1940 an, krom at ografi m ulai berkem bang. Dasar krom at ografi lapisan t ipis ( TLC) dilet akkan pada t ahun 1938 oleh I zm ailov dan Schreiber, dan kem udian diperhalus oleh St ahl pada t ahun 1958. Hasil karya yang baik sekali dari Mart in dan Synge pada t ahun 1941 ( unt uk ini m ereka m em enangkan Nobel) t idak hanya m engubah dengan cepat kroinat ografi cair t et api seperangkat um um langkah unt uk pengem bangan krom at ografi gas dan krom at ografi kert as. Pada t ahun 1952 Mart in dan Jam es m em publikasikan m akalah pert am a m engenai krom at ografi gas. Diant ara t ahun 1952 dan akhir t ahun 1960 an krom at ografi gas dikem bangkan m enj adi suat u t eknik analisis yang canggih. Krom at ografi cair, dalam prakt ek dit am pilkan dalam kolom gelas berdiam et er besar, pada dasam ya dibawah kondisi at m osfer. Wakt u analisis lam a dan segala prosedur biasanya sangat m em bosankan. Pada akhir t ahun 1960 an, sem akin banyak usaha dilakukan unt uk pengem bangan krom at ografi cair sebagai suat u t eknik m engim bangi krom at ografi gas. High Perform ance Liquid Chrom at ography ( HPLC) at au Krom at ografi Cair Penam pilan Tinggi at au High Preform ance = Tekanan at au Kinerj a Tinggi, High Speed = Kecepat an Tinggi dan Modern = m oderen) t elah berhasil dikem bangkan dari usaha ini. Kem aj uan dalam keduanya inst rum ent asi dan pengepakan kolom t erj adi dengan cepat nya sehingga sulit unt uk m em pert ahankan suat u bent uk hasil keahlian m em buat inst rum ent asi dan pengepakan kolom dalam keadaan t ert ent u. Tent u saj a, saat ini dengan t eknik yang sudah m at ang dan dengan cepat KCKT m encapai suat u keadaan yang sederaj at dengan krom at ografi gas. 1 .2 . Ke le bih a n KCKT Krom at ografi Cair Kinerj a Tinggi ( KCKT) at au High Pressure Liquid Chrom at ography ( HPLC) m erupakan salah sat u m et ode kim ia dan fisikokim ia. KCKT t erm asuk m et ode analisis t erbaru yait u suat u t eknik krom at ografi dengan fasa gerak

© 2004 Digit ized by USU digit al library

1

cairan dan fasa diam cairan at au padat . Banyak kelebihan m et ode ini j ika dibandingkan dengan m et ode lainnya ( Done dkk, 1974; Snyder dan Kirkland, 1979; Ham ilt on dan Sewell, 1982; Johnson dan Stevenson, 1978) . Kelebihan it u ant ara lain: • m am pu m em isahkan m olekul- m olekul dari suat u cam puran • m udah m elaksanakannya • kecepat an analisis dan kepekaan yang t inggi • dapat dihindari t erj adinya dekom posisi / kerusakan bahan yang dianalisis • Resolusi yang baik • dapat digunakan berm acam - m acam det ekt or • Kolom dapat digunakan kem bali • m udah m elakukan " sam ple recovery" I I . JEN I S- JEN I S KROM A TOGRAFI 2 .1 . Kr om a t ogr a fi pa da t a n ca ir ( LSC) Teknik ini t ergant ung pada t eradsorpsinya zat padat pada adsorben yang polar sepert i silika gel at au alum ina. Krom at ografi lapisan t ipis ( TLC) adalah salah sat u bent uk dari LSC. Dalam KCKT kolom dipadat i at au dipak dengan part ikelpart ikel m icro or m acro part iculat e or pellicular ( berkulit t ipis 37 - 44 µ) .Sebagian besar dari KCKT sekarang ini dibuat unt uk m encapai part ikel- part ikel m icropart iculat e lebih kecil dari 20µ . Teknik ini biasanya digunakan unt uk zat padat yang m udah larut dalam pelarut organik dan t idak t erionisasi. Teknik ini t erut am a sangat kuat unt uk pem isahan isom er- isom er. 2 .2 . Kr om a t ogr a fi pa r t isi Teknik ini t ergant ung pada part isi zat padat diant ara dua pelarut yang t idak dapat bercam pur salah sat u diant aranya bert indak sebagai rasa diam dan yang lainnya sebagai fasa gerak. Pada keadaan awal dari krom at ografi cair ( LSC) , rasa diam nya dibuat dengan cara yang sam a sepert i pendukung pada krom at ografi gas ( GC) . Fasa diam ( polar at au nonpolar) dilapisi pada suat u pendukung inert dan dipak kedalam sebuah kolom . Kem udian rasa gerak dilewat kan m elalui kolom . Bent uk krom at ografi part isi ini disebut krom at ografi cair cair ( LLC) Unt uk m em enuhi kebut uhan akan kolom - kolom yang dapat lebih t ahan lam a, t elah dikem bangkan pengepakan fase diam yang berikat an secara kim ia dengan pendukung inert . Bent uk krom at ografi part isi ini disebut krom at ografi fase t erikat ( BPC = Bonded Phase Chrom at ography) . BPC dengan cepat m enj adi salah sat u bent uk yang paling populer dari KCKT. Krom at ografi part isi ( LLC dan BPC) , disebut " fase norm al" bila fase diam lebih polar dari fase gerak dan " fase t erbalik" bila fase gerak lebih polar dari pada fase diam . 2 .3 . Kr om a t ogr a fi pe n u k a r ion ( I EC) Teknik ini t ergant ung pada penukaran ( adsorpsi) ion- ion di ant ara fase gerak dan t em pat - t em pat berion dari pengepak. Kebanyakan m esin- m esin berasal dari kopolim er divinilbenzen st iren dim ana gugus- gugus fungsinya t elah dit am bah. Asam sulfonat dan am in kuart erner m erupakan j enis resin pilihan paling baik unt uk digunakan Keduanya, fase t erikat dan resin t elah digunakan. Teknik ini digunakan secara luas dalam life sciences dan dikenal unt uk pem isahan asam - asam am ino. Teknik ini dapat dipakai unt uk keduanya kat ion dan anion. 2 .4 . Kr om a t ogr a fi e k sk lu si Teknik ini unik karena dalam pem isahan didasarkan pada ukuran m olekul dari zat padat . Pengepak adalah suat u gel dengan perm ukaan berlubang- lubang sangat kecil ( porous) yang inert . Molekul- rnolekul kecil dapat m asuk dalarn j aringan dan

© 2004 Digit ized by USU digit al library

2

dit ahan dalam fase gerak yang m enggenang ( st agnat m obile phase) . Molekulm olekul yang lebih besar, t idak dapat m asuk kedalam j aringan dan lewat m elalui kolom t anpa dit ahan. Krom at ografi eksklusi rnernpunyai banyak nam a, yang paling um um disebut perm easi gel ( GPC) dan filt rasi gel. Apapun nam anya, m ekanism enya t et ap sam a. Dalam bidang biologi, Sephadex, suat u Cross- linked dext ran gel, t elah digunakan secara luas, hanya pengepak keras dan sem i keras ( polist iren, silika, glass) yang digunakan dalam KCKT. Dext ran gel lunak t idak dapat m enahan kinerj a diat as 1 at au 2 at m osfer. Tenik ini dikem bangkan unt uk analisis polim er- polim er dan bahan- bahan biologi, t erut am a digunakan unt uk rnolekul- m olekul kecil. 2 .5 . Kr om a t ogr a fi pa sa n ga n ion ( I PC) Krom at ogt afi pasangan ion sebagai penyesuaian t erhadap KCKT t erm asuk baru, pem akaian pert am a sekali pada pert engahan t ahun 1970. Dit erim anya I PC sebagai m et ode baru KCKT m erupakan hasil kerj a Schill dan kawan- kawan dan dari beberapa keunt ungan yang unik. Kadang- kadang I PC disebut j uga krom at ografi ekst raksi, krom at ografi dengan suat u cairan penukar ion dan paired ion chrom at ography ( PI C) . Set iap t eknik- t eknik ini m em punyai dasar yang sam a. Popularit as I PC m uncul t erut am a sekali dari ket erbat asan I EC dan dari sukanya m enangani sam pel- sam pel t ert ent u dengan m et ode- m et ode LC lainnya ( sepert i senyawa yang sangat polar, senyawa yang t erionisasi secara kom pleks dan senyawa basa kuat ) . I PC dapat dilaksanakan dalam dua t ipe yait u fase norm al dan fase balik. Fase diam dari rase balik I PC dapat t erdiri dari suat u pengepak silika yang disilanisasi ( m isalnya C8 at au C18 Bonded Phase) at au dari suat u pengepak yang diperoleh secara m ekanik, fase organik yang t idak dapat bercam pur dengan air sepert i 1 pent anol. Fase diam yang dipakai adalah Cs at au CI S BPC Packing. Fase gerak t erdiri dari suat u larut an bufer ( dit am bah suat u kosolven organik sepert i m et anol at au aset onit ril unt uk pem isahan fase t erikat ) dan suat u penam bahan ion t anding,yang m uat annya berlawanan dengan m olekul sam pel. Sebagai cont oh, unt uk pem isahan suat u kelom pok asam - asam karboksilat m enggunakan suat u fase gerak yang dibufer pada pH 7,0 supaya sem ua senyawasenyawa sam pel berada dalam bent uk RCOO ( dilam bangkan dengan R) . I on t anding dalam hal ini bisa berupa t et rabut yl am m onium ion, BU4 N+ ( at au TBA+ ) .Dalam hal yang paling sederhana dari I PC, dapat dianggap bahwa sam pel dan ion t anding dapat lam a hanya dalam fase gerak air, dan pasangan ion yang dibent uk dari ion- ion ini dapat larut hanya dalam fase diam organik. Dalam hal ini dapat dit ulis persam aan unt uk dist ribusi sam pel R- diant ara dua fase :

pa sa nga n I on Tulisan aq dan org m enunj ukkan fase air dan rase organik. Konst ant a ekst raksi E selanj ut nya dit et apkan dengan persam aan :

Dim ana E adalah konst ant unt uk suat u sist em I PC khusus, t et api bervariasi dengan pH fase gerak dan kekuat an ion, konsent rasi dan j enis kosolven organik didalam fase gerak ( m isal m et anol at au aset onit ril) dan suhu. Kapasit as fakt or k 3 ,berhubungan dengan E sebagai berikut :

© 2004 Digit ized by USU digit al library

3

Maka harga k 3 unt uk sem ua senyawa- senyawa sam pel ( unt uk unit berm uat an negat if) diduga sebanding dengan konsent rasi ion t anding TBA+ . Cat at an bahwa koefisien dist ripbusi K berhubungan dengan E sehingga.

Variasi dari ( TBA+ ) aq m em berikan suat u cara unt uk m engont rol kekuat an solven dalam selekt ifit as. Dalam sist em fase balik, kekuat an solven dengan m udah dapat divariasi dengan m engubah ion t anding at au konsent rasinya. Unt uk sist em fase balik pem isahan sam apel anion at au sam pel kat ion dapat dirum uskan dengan :

Disini konsent rasi ( C+ ) dan ( C- ) , bert urut - t urut m enunj ukkan konsent rasi ion t anding kat ion dan konsent rasi ion t anding anion, dan E adalah konst an walaupun kondisikondisi lainnya diubah. Maka bert am bahnya konsent rasi dari ion t anding dalam fase gerak m enyebabkan bert am bahnya k 3 unt uk I PC fase bat ik ( dan berkurang pada JPC fase norm al) . Persam aan ( 6) dan ( 7) unt uk ion- ion sam pel t erionisasi t unggal. Unt uk ion- ion sam pel bivalen at au t rivalen, k’ berubah bert urut - t urut m enj adi ( C+ ) 2 at au ( C+ ) 3. Dalam I PC fase norm al, k' dapat divariasi dengan m engubah konsent rasi ion t anding dalam fase diam . Nam un, hal ini kurang t epat karena berart i harus m engubah fase diam ( m engisi kem bali kolom = reloading t he colum n) . Dalam operasional fase norm al at aupun fase balik I PC, k' dapat j uga divariasi dengan m engubah j enis ion t anding ( m isalnya m enggant i pent an sulfonat dengan hept an sulfonat ) . Penam bahan sat u gugus CH2 kepada m olekul ion t anding m enghasilkan suat u fakt or sam pai 2,5 kali ( efek lebih besar pada ion t anding dengan konsent rasi rendah) , m olekul- m olekul ion t anding yang lebih besar m em berikan harga k' lebih kecil pada I PC fase norm al. Kekuat aan solven baik dalam fase norm al at aupun fase balik I PC dapat j uga divariasi dengan m erubah polarit as fase gerak. Unt uk sist em fase balik I PC t anpa penam bahan fase diam organik, cam puran air dengan salah sat unya m et anol at au aset onit ril biasanya digunakan sebagai fase gerak. Bila persent ase air dikurangi, m aka pelarut m enj adi lebih kuat dan harga k' sam pel berkurang. Selain dari pada m enaikkan konsent rasi ion t anding, m enaikkan kekuat an ionik didalam fase air biasanya m engurangi pem bent ukan pasangan- pasangan ion, sebagai suat u hasil kom pet isi dari ion- ion sekunder dalam m em bent uk pasangan-

© 2004 Digit ized by USU digit al library

4

pasangan ion dengan ion t anding. Maka suat u kenaikan/ pert am bahan kekuat an ion akan m enurunkan harga k' pada I PC fase balik dan akan m eninggikan harga k' pada rase norm al I PC. Sat u st udi m em bukt ikan bahwa 2 sam pai 3 kali lipat perubahan k' unt uk set iap m enggandakan kekuat an ion. I on- ion sekunder yang m uat annya sam a dengan m uat an ion sam pel ( m isal : kat ionik at au anionik) m em punyai efek yang paling besar pada harga k' sam pel. Dalam suat u st udi m eliput i pem isahan anionanion sam pel dengan I PC, efek dari ion- ion sekunder t erhadap k' bert am bah dalam urut an NO3 < Br< C1< SO4 - 2

I I I . KOM PON EN - KOM PON EN KCKT Kom ponen- kom ponen pent ing dari KCKT dapat dilihat pada Gam bar 3. 1 . Diagram Blok KCKT berikut ini

Gam bar 3.1 : Diagram Blok KCKT 3 .1 . Pom pa ( Pum p) Fase gerak dalam KCKT adalah suat u cairan yang bergerak m elalui kolom . Ada dua t ipe pom pa yang digunakan, yait u kinerj a konst an ( const ant pressure) dan pem indahan konst an ( const ant displacem ent ) . Pem indahan konst an dapat dibagi m enj adi dua, yait u: pom pa reciprocat ing dan pom pa syringe. Pom pa reciprocat ing m enghasilkan suat u aliran yang berdenyut t erat ur ( pulsat ing) ,oleh karena it u m em but uhkan peredam pulsa at au peredam elekt ronik unt uk, m enghasilkan garis dasar ( base line) det ekt or yang st abil, bila det ekt or sensit if t erhadapan aliran. Keunt ungan ut am anya ialah ukuran reservoir t idak t erbat as. Pom pa syringe m em berikan aliran yang t idak berdenyut , t et api reservoirnya t erbat as. 3 . 2 . I n j e k t or ( in j e ct or ) Sam pel yang akan dim asukkan ke bagian uj ung kolom , harus dengan dist urbansi yang m inim um dari m at erial kolom . Ada dua m odel um um : a. St opped Flow b. Solvent Flowing Ada t iga t ipe dasar inj ekt or yang dapat digunakan : a. St op- Flow: Aliran dihent ikan, inj eksi dilakukan pada kinerj a at m osfir, sist em t ert ut up, dan aliran dilanj ut kan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi t idak dipengaruhi b. Sept um : Sept um yang digunakan pada KCKT sam a dengan yang digunakan pada Krom t ografi Gas. I nj ekt or ini dapat digunakan pada kinerj a sam pai 60 70 at m osfir. Tet api sept um ini t idak t ahan dengan sem ua pelarut - pelarut Krom at ografi Cair.Part ikel kecil dari sept um yang t erkoyak ( akibat j arum inj ekt or) dapat m enyebabkan penyum bat an.

© 2004 Digit ized by USU digit al library

5

c. Loop Valve: Tipe inj ekt or ini um um nya digunakan unt uk m enginj eksi volum e lebih besar dari 10 µ dan dilakukan dengan cara aut om at is ( dengan m enggunakan adapt or yang sesuai, volum e yang lebih kecil dapat diinj eksifan secara m anual) . Pada posisi LOAD, sam pel diisi kedalam loop pada kinerj a at m osfir, bila VALVE difungsikan, m aka sam pel akan m asuK ke dalam kolom . 3 . 3 . Kolom ( Colum n ) Kolom adalah j ant ung krom at ografi. Berhasil at au gagalnya suat u analisis t ergant ung pada pem ilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi m enj adi dua kelom pok : a. Kolom analit ik : Diam et er dalam 2 - 6 m m . Panj ang kolom t ergant ung pada j enis m at erial pengisi kolom . Unt uk kem asan pellicular, panj ang yang digunakan adalah 50 - 100 cm . Unt uk kem asan poros m ikropart ikulat , 10 - 30 cm . Dewasa ini ada yang 5 cm . b. Kolom preparat if: um um nya m em iliki diam et er 6 m m at au lebih besar dan panj ang kolom 25 - 100 cm . Kolom um um nya dibuat dari st ainlest eel dan biasanya dioperasikan pada t em perat ur kam ar, t et api bisa j uga digunakan t em perat ur lebih t inggi, t erut am a unt uk krom at ografi penukar ion dan krom at ografi eksklusi. Pengepakan kolom t ergant ung pada m odel KCKT yang digunakan ( Liquid Solid Chrom at ography, LSC; Liquid Liquid Chrom at ography, LLC; I on Exchange Chrom at ography, I EC, Exclut ion Chrom at ography, EC) 3 . 4 . D e t e k t or ( D e t e ct or ) . Suat u det ekt or dibut uhkan unt uk m endet eksi adanya kom ponen sam pel di dalam kolom ( analisis kualit at if) dan m enghit ung kadam ya ( analisis kuant it at if) .Det ekt or yang baik m em iliki sensit ifit as yang t inggi, gangguan ( noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan m em beri respons unt uk sem ua t ipe senyawa. Suat u kepekaan yang rendah t erhadap aliran dan flukt uasi t em perat ur sangat diinginkan, t et api t idak selalu dapat diperoleh. Det ekt or KCKT yang um um digunakan adalah det ekt or UV 254 nm . Variabel panj ang gelom bang dapat digunakan unt uk m endet eksi banyak senyawa dengan range yang lebih luas. Det ekt or indeks refraksi j uga digunakan secara luas, t erut am a pada krom at ografi eksklusi, t et api um um nya kurang sensit if j ika dibandingkan dengan det ekt or UV. Det ekt or- det ekt or lainnya ant ara lain: Det ekt or Fluorom et er - Det ekt or Spekt rofot om et er Massa Det ekt or lonisasi nyala - Det ekt or Refraksi lndeks Det ekt or Elekt rokim ia - Det ekt or Reaksi Kim ia 3 . 5 . Elu si Gr a die n Elusi Gradien didefinisikan sebagai penam bahan kekuat an fasa gerak selam a analisis krom at ografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah m em persingkat wakt u ret ensi dari senyawa- senyawa yang t ert ahan kuat pada kolom . Dasar- dasar elusi gradien dij elaskan oleh Snyder. Elusi Gradien m enawarkan beberapa keunt ungan : a. Tot al wakt u analisis dapat direduksi b. Resolusi persat uan wakt u set iap senyawa dalam cam puran bert am bah c. Ket aj am an Peak bert am bah ( m enghilangkan t ailing) d. Efek sensit ivit as bert am bah karena sedikit variasi pada peak Gradien dapat dihent ikan sej enak at au dilanj ut kan. Opt im asi Gradien dapat dipilih dengan cara t rial and error. Tabel 3. 1. berikut ini m enunj ukkan kom pat ibilit as dari berm acam - m acarn m ode krom at ografi cair dengan analisis gradien. Dalam prakt ek, gradien dapat diform asi sebelum dan sesudah pom pa.

© 2004 Digit ized by USU digit al library

6

Tabel 3. 1 : Mode Kom pat ibilit as dengan Gradien Mode Krom at ografi Krom at ografi Krom at ografi Krom at ografi Krom at ografi

Cair padat ( LSC) ekslusi Penukar I on ( I EC) Cair Cair ( LLC) Fasa Terikat ( BPC)

Solven Gradien Ya Tidak Ya Tidak Ya

3 . 6 . Pe ngola h a n D a t a ( D a t a H a n dling) Hasil dari pem isahan krom at ografi biasanya dit am pilkan dalam bent uk krom at ogram pada rekorder. Suat u t ipe Krom at ogram dapat dilihat pada Gam bar 3. 2 berikut ini

Ga m ba r 3 .2 : k r om a t ogr a m da r i se n ya w a 5 ’ N u k le ot ida Dari Gam bar 3.2. wakt u ret ensi dan volum e ret ensi dapat diket ahui / dihit ung. Lni bisa digunakan unt uk m engident ifikasi secara kualit at if suat u kom ponen, bila kondisi kerj a dapat dikont rol. Lebar puncak dan t inggi puncak sebanding at au proporsional dengan konsent rasi dan dapat digunakan unt uk m em peroleh hasil secara kuant it at if. 3 . 7 . Fa sa ge r a k Di dalam krom at ografi cair kom posisi dari solven at au rasa gerak adalah salah sat u dari variabel yang m em pengaruhi pem isahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven yang digunakan unt uk KCKT, t et api ada beberapa sifat um um yang sangat disukai, yait u rasa gerak harus : 1. Murni, t idak t erdapat kont am inan 2. Tdak bereaksi dengan wadah ( packing) 3. Sesuai dengan defekt or 4. Melarut kan sam pel 5. Mem iliki visikosit as rendah 6. Bila diperlukan, m em udahkan " sam ple recovery" 7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga m urah ( reasonable price) Um um nya, sem ua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena...