Laporan HPLC Parasetamol PDF

Preview

Summary

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan...

Description

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam.Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah.Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom. Kromatografi digunakan untuk memisahkan campuran dari substansinya menjadi komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi bekerja berdasarkan prinsip yang sama.Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan atau cairan yang didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponenkomponen dari campuran bersama-sama. Komponen-komponen yang berbeda akan bergerak pada laju yang berbeda pula. HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan dengan memakai fase diam yang terikat secara kimia pada penyangga halus yang distribusi ukuranya sempit ( kolom ) dan fase gerak yang dipaksa mengalir dengan laju alir yang terkendali dengan memakai tekanan tinggi sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan waktu yang relative singkat. HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi; lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri- industri makanan.

1.2 Tujuan praktikum 1. Membuat parameter validasi (akurasi, presisi, uji perolehan kembali, LOD, LOQ ) 2. Penetapan kadar dalam sediaan ( berdasarkan farmakope Indonesia )

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Landasan Teori PARASETAMOL 1. Sifat Fisikokimia Rumus struktur :

Nama Kimia : 4- Hidroksiasetanilida Rumus Molekul : C8H9NO2 Berat Molekul : 151,16 Pemerian : serbuk, putih, tidak berbau, rasa sedikit pahit. Kelarutan : larut dalam air mendidih dan dalam natrium hidroksida 1 N, mudah larut dalam etanol. (Depkes RI, 1995). Farmakokinetik, Parasetamol diberikan secara oral, diserap dengan baik melalui saluran cerna. Penyerapan dihubungkan dengan tingkat pengosongan lambung. Konsentrasi darah puncak biasanya tercapai dalam 30 - 60 menit. Parasetamol sedikit terikat pada protein plasma dan sebagian dimetabolisme oleh enzim mikrosoma hati dan diubah menjadi sulfat dan glukoronida. (Katzung, 2002). Kegunaan, Asetaminofen merupakan pengganti yang baik untuk analgesik dan antipiretik aspirin pada penderita dengan keluhan saluran cerna dan pada mereka dengan perpanjangan waktu perdarahan yang tidak menguntungkan. Asetaminofen merupakan analgetik dan antipiretis. Asetaminofen tidak mengantagonis obat urikosurik probenesid dan karena itu dapat digunakan pada penderita gout yang mendapatkan obat itu.

KOFEIN 1. Sifat Fisikokimia Rumus struktur :

Nama Kimia : 1,3,7-Trimetil xantin Rumus Molekul : C8H10N4O2 Berat Molekul : 194,19 Pemerian : serbuk putih atau bentuk jarum mengkilat putih,biasanya menggumpal, tidak berbau, rasa pahit. Kelarutan : Agak sukar larut dalam air, dalam etanol, mudah larut dalam kloroform, sukar larut dalam eter. (Depkes RI, 1995). Farmakokinetik, Kafein per oral mudah diabsorbsi. Kafein tersebar ke seluruh tubuh termasuk otak. Obat dapat melewati plasenta janin dan disekresikan ke dalam ASI. Dimetabolisme di hati dan metabolitnya dikeluarkan di dalam urin. Fungsi, Kofein berkhasiat menstimulasi SSP, dengan efek menghilangkan rasa letih, lapar dan mengantuk, juga daya konsentrasi dan kecepatan reaksi dipertinggi, prestasi otak dan suasana jiwa diperbaiki. Kofein juga memperkuat kontraksi jantung, vasodilatasi perifer dan diuretis. Kofein digunakan sebagai penyegar. Zat ini sering dikombinasikan dengan Parasetamol atau asetosal untuk memperkuat efek analgetisnya. Kromatografi Dalam analisis kimia pada umumnya, komponen (zat) yang akan dianalisa harus dipisahkan terlebih dahulu dari komponen lain atau zat pengganggu yang ada, lalu dipekatkan, kemudian baru diidentifikasi atau diukur kuantitasnya. Banyak teknik pemisahan zat yang digunakan, tetapi kromatografi adalah teknik yang paling banyak dipakai, terutama untuk campuran yang kompleks. Suatu komponen campuran yang tidak mungkin dipisahkan

dengan cara yang lain, menggunakan kromatografi dapat diselesaikan dalam waktu yang singkat dengan peralatan yang relatif sederhana. Lebih dari itu, karena sifat pemisahannya yang spesifik, maka selain digunakan sebagai metode pemisahan, kromatografi juga merupakan metode penentuan zat baik kualitatif maupun kuantitatif. Kromatografi dapat didefinisikan sebagai suatu teknik pemisahan zat berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi yang berlangsung dalam suatu sistem yang terdiri dari dua macam fasa, dimana salah satu fasa bergerak (fasa gerak) atas fasa lainnya (fasa diam). Kromatografi apapun bentuknya mempunyai 2 macam fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak. Berdasarkan jenis fasa gerak yang digunakan, kromatografi dibedakan atas 2 golongan besar yaitu kromatografi gas bila fasa geraknya gas dan kromatografi cair bila fasa geraknya cairan. Pada kromatografi gas, fasa diam selalu ditempatkan di dalam kolom. Fasa diam itu dapat berupa padatan atau cairan yang diemban oleh butiran halus zat padat pendukung. Karena itu berdasarkan wujud fasa diamnya, kromatografi gas dapat dibedakan atas kromatografi gas padat dan kromatografi gas cair. Pada kromatografi cair, selain ditempatkan dikolom, fasa diam dapat pula ditebarkan berupa lapis tipis diatas permukaan suatu pelat dari kaca yang disebut kromatografi lapis tipis. Selain itu dapat pula menggunakan secarik kertas sebagai fasa diamnya yang disebut kromatografi kertas. Kromatografi lapis tipis dan kromatografi kertas dilakukan untuk membedakannya dari kromatografi yang dilakukan di dalam sebuah kolom, yang dinamakan kromatografi kolom. Didalam kromatografi cair pun dikenal pula kromatografi cair-padat dan kromatografi cair-cair, tergantung pada fasa diam yang digunakan. Selain berdasarkan wujud fasa gerak dan fasa diam yang digunakan, kromatografi dapat dibedakan berdasarkan mekanisme interaksi yang terjadi antara fasa diam dan komponen campuran yang dipisahkan. Maka dikenal kromatografi adsorbsi, kromatografi partisi, kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi atau permiasi gel. Mekanisme interaksi yang paling banyak dijumpai dilaboratorium adalah adsorbsi dan partisi. Pada proses adsorbsi, molekul pelarut dan molekul zat terlarut menempati permukaan zat padat pengadsorbsi (adsorbent). Dalam kromatografi partisi, fungsi zat padat pengadsorbsi sebagai fasa diam digantikan oleh zat cair. Distribusi komponen dalam fasa diam itu karena daya larutnya. Pada kromatografi cair, misalnya Kromatografi cair Kinerja

Tinggi(KCKT), molekul senyawa yang digunakan sebagai fasa diam diikatkan secara kimia pada permukaan pertikel pendukung, menghasilkan kromatografi fasa terikat. Berdasarkan perbandingan polaritas antara fasa diam dan fasa geraknya dikenal kromatografi fasa normal bila fasa diam lebih polar dari fasa geraknya, kromatografi fasa terbalik bila fasa gerak lebih polar daripada fasa diamnya. Karena fasa diam yang digunakan tidak sebanyak pada kromatografi gas, maka selektifitas pemisahan lebih mudah diperbaiki dengan merubah komposisi fasa gerak. (Sudaryo, 2001). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Kromatogarfi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi karena didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam sehingga mampu menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran (Depkes RI, 1995). 1. Komponen Kromatografi cair kinerja tinggi

2. Skema kerja alat Kromatografi cair kinerja tinggi

1. Wadah Fase gerak Wadah fase gerak terbuat dari bahan yang inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum digunakan adalah gelas dan baja anti karat. Daya tampung tandon harus lebih besar dari 500 ml, yang dapat digunakan selama 4 jam untuk kecepatan alir yang umumnya 1-2 ml/menit. 2. Pompa Untuk menggerakkan fase gerak melalui kolom diperlukan pompa. Pompa harus mampu menghasilkan tekanan 6000 Psi pada kecepatan alir 0,1–10 ml/menit. Pompa ada 2 jenis yaitu pompa volume konstan dan pompa tekanan konstan. Pompa terbuat dari bahan yang inert terhadap semua pelarut. Bahan yang umum digunakan adalah gelas baja antikarat dan teflon. Aliran pelarut dari pompa harus tanpa denyut untuk menghindari hasil yang menyimpang pada detektor. 3. Injektor Cuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan agar sesedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada tiga jenis dasar injektor, yaitu:

a. Hentikan aliran/stop flow Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Tehnik ini bisa digunakan karena difusi di dalam aliran kecil dan resolusi tidak dipengaruhi. b. Septum Injektor-injektor langsung ke aliran fase gerak umumnya sama dengan yang digunakan pada kromatografi gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Disamping itu, partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan. c. Katup putaran (loop valve) ditunjukkan secara skematik dalam Gambar 6, tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari pada 10 l dan sekarang digunakan dengan cara automatis (dengan adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara

manual). Pada posisi LOAD, sampel loop (cuplikan dalam putaran) diisi pada tekanan atmosfir. Bila katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak ke dalam kolom. 4. Kolom Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Perbandingan antara 2 kolom tersebut :

Parameter

Kolom konvensional

Kolom mikrobor

Tabung

Stainless steel

Stainless steel

Panjang 3,10,15,20 dan 25 cm.

Panjang 25 dan 50 cm

Diameter luar :0,25 inci; dalam : 4,6 mm

Diameter luar : 0,25 inci; dalam

Kolom

: 2 mm Fase diam

Porous, silica ukuran kecil dan yang Porous, silica ukuran kecil dan dimodifikasi secara kimiawi, polimer- yang polimer stiren/divinil benzene.

dimodifikasi

kimiawi,

secara

polimer-polimer

stiren/divinil benzene. Tekanan

500-3000 psi (35-215 bar)

1000-5000 psi (70-350 bar)

operasional Fase gerak

Hidrokarbon

pelarut-pelarut Hidrokarbon + pelarut-pelarut

+

terklorinasi atau alcohol untuk fase terklorinasi atau alcohol untuk normal. Untuk fase terbalik digunakan fase normal. Untuk fase terbalik methanol atau asetonitril + air atau digunakan

methanol

atau

buffer.

asetonitril + air atau buffer.

Kecepatan alir : 1-3 ml/menit

Kecepatan

alir

:

10-100

µl/menit. Kinerja

Efisiensi

meningkat

dengan Sangat efisien dan sensitive,

berkurangnya ukuran pertikel fase diam, tetapi lambat tetapi

umur

kolom

dengan

pertikel 3 µm lebih pendek

ukuran

Konsumsi

fase

gerak

lebih

hemat yaitu ¼ dari kolom konvensional.

Beberapa keuntungan dari kolom mikrobor : -

Kapasitas aliran fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 l/menit).

-

Kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa karena memiliki aliran fase gerak yang lebih lambat.

-

Adanya peningkatan sensitifitas kolom karena solute yang lebih pekat.

Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Kemasan kolom tergantung pada mode kromatografi cair kinerja tinggi yang digunakan. 5. Detektor Detektor pada KCKT dikelompokkkan menjadi 2 golongan yaitu: -

Detektor universal: Mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif, seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa.

-

Detektor spesifik: Hanya mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi dan elektrokimia (Rohman,2007).

Karakteristik suatu detector pada KCKT: •

Mempunyai respon terhadap solute yang cepat dan reprodusibel.

•

Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil.

•

Stabil dalam pengopersiannya.

•

Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita. Untuk kolom konvensional, selnya bervolume 8 µl atau lebih kecil, sedangkan kolom mikrobor selnya bervolume 1 µl atau lebih kecil.

•

Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).

•

Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Beberapa detector yang sering digunakan dalam KCKT : Detektor

Sensitifitas Kisar (g/ml)

Karakteristik

an Linea r

Spektrofotometri UV-Vis

5 x 10-10

104

5 x 10-10

105

˃2 x 10 Fluoresensi

10-12

-10

10

5

104

Sensitifitas bagus, paling sering digunakan, selektif terhadap gugus dan struktur-struktur yang tidak jenuh. Sensitifitas sangat bagus, tidak peka terhadap

perubahan

suhu

dan

kecepatan alir fase gerak. Indeks bias

5 x 10-7

104

Hampir bersifat universal akan tetapi

sensitivitasnya

sedang.

Sangat sensitive terhadap suhu, dan tidak dapat digunakan pada elusi bergradien. Elektrokimia

10-8

104

10-12

105

Peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak, tidak dapat

digunakan

pada

elusi

bergradien.

Hanya

mendeteksi

solute-solut

ionic.

Sensitifitas

sangat bagus, selektif tetapi timbul masalah

dengan

adanya

kontaminasi elektroda

6. Fase Gerak Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini

ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponenkomponen sampel (Johnson dan Stevenson, 1991; Munson, 1991 dan Rohman, 2007). Terdapat keragaman yang luas dari solvent yang digunakan dalam semua mode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, tetapi ada beberapa sifat yang diinginkan yang mana umumnya harus dipenuhi oleh semua solven. 1. Fase gerak harus: - Murni; tidak ada pencemar/kontaminan - Tidak bereaksi dengan pengemas - Sesuai dengan detektor - Melarutkan cuplikan - Mempunyai viskositas rendah - Mudah rekoveri cuplikan, bila diinginkan - Tersedia diperdagangan dengan harga yang pantas (Putra, 2003) 2. Elusi gradien dan isokratik Elusi pada kromatografi cair kinerja tinggi dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu: 1.

Sistem elusi isokratik. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fase gerak dengan perbandingan tetap (komposisi fase gerak tetap selama elusi)

2.

Sistem elusi gradien. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fase gerak yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi). puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram.

Guna kromatogram: 1.

Kualitatif

waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi yang sama. dapat digunakan untuk identifikasi. 2.

Kuantitatif

luas puncak proporsional dengan jumlah sampel yang diinjesikan dan dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi. 3.

Kromatogram dapat digunakan untuk mengevaluasi efisiensi pemisahan dan kinerja kolom

3. Parameter Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Ada beberapa parameter yang perlu diperhatikan dalam memperoleh kondisi yang diinginkan dalam kromatografi antara lain : a. Waktu Retensi Waktu yang dibutuhkan suatu komponen untuk melewati suatu kolom disebut waktu retensi yang dapat didefinisikan sebagai waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu komponen dari dalam kolom, dihitung mulai diinjeksikan hingga keluar kolom tepat pada saat konsentrasi maksimum. b. Faktor Selektifitas Suatu kolom dinyatakan baik apabila kolom tersebut cukup selektif, dan dikatakan selektif apabila kolom tadi mampu menahan berbagai komponen dengan kekuatan yang berbeda-beda. c. Efisiensi Kolom Jumlah plat teoritik dalam suatu kolom sebanding dengan panjang kolom. Karena itu jumlah plat teoritik suatu kolom dapat ditingkatkan dengan memperpanjang kolom. Makin panjang kolom makin banyak jumlah plat teoritiknya maka makin sempurna pemisahan.

d. Resolusi Derajat pemisahan atau resolusi dari dua pita yang berdekatan didefinisikan sebagai jarak antara puncak-puncak pita (atau pusat-pusat) dibagi dengan luas pita rata-rata. Semakin tinggi harga N selalu memberikan resolusi yang membaik. Oleh karena itu resolusi dapat diperbaiki dengan menambah panjang kolom. (Putra, 2003). e. Faktor Ikutan Keasimetrisan puncak dinyatakan dengan faktor ikutan atau faktor asimetris. Pembentukan puncak yang curam bagian depan tetapi landai bagian belakang disebut tailing, sebaliknya puncak yang landai bagian depan dan curam bagian belakang disebut fronting. Keuntungan analisis menggunakan KCKT : •

Dapat dilakukan pada suhu kamar.

•

Kolom dapat digunakan berkali-kali atau berulang.

•

Detector HPLC dapat divariasi dan tersedia dalam beberapa pilihan.

•

Waktu analisis pada umumnya singkat.

•

Ketepatan,kepekaan dan ketelitiannya yang relatif tinggi.

•

Mudah dioperasikan secara otomatis.

•

Pencuplikan sampel lebih akurat dan kuantitatif karena adanya autosampler.

•

Resolusinya baik.

Kerugian analisis menggunakan KCKT : •

Harganya mahal sehingga penggunaannya terbatas

•

Kompatibilitas antara pelarut, fase diam dan solute harus diketahui terlebih dahulu

•

Menggunakan pelarut yang banyak.

BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3.1. Alat dan Bahan Alat :

Bahan :

1. HPLC

1. Baku standar (kafein, parasetamol)

2. Beaker glass

2. Aquadest

3. Labu ukur 100 ml

3. Obat Oskadon

4. Labu ukur 50 ml 5. Lumpang dan alu 6. Timbangan analitik 7. Seperangkat Mikro pipet

3.2. Cara kerja: Prosedur Kerja Praktikum III (kualitatif) 1.

Pembuatan larutan induk kafein dan paracetamol dibuat masing-masing 100 ppm

2.

Pembuatan lar...