Lecture 5 Modiefied amino acids PDF

Preview

Summary

Download Lecture 5 Modiefied amino acids PDF

Description

Lecture 5 Modiefied amino acids, ionization balance and pI Dienstag 27.10.2020 Mit Aminosäuren Quiz



Das Thema von heute sind die modifizierten und nicht proteinogenen Aminosäuren, denn neben den proteinogenen haben wir auch Aminosäuren und Proteine, die nach der Translation, d.h. nach der Proteinbiosynthese, modifiziert wurden.



Aminosäuren sind auch in anderen Bereichen des Stoffwechsels wichtig (als in Proteinen und Enzymen), und das sind die nicht proteinogenen Aminosäuren von Proteinen. (Beispiele)



Ionisationsgleichgewicht in den Aminosäuren, weil Sie bereits wissen, dass Aminosäure bei dem physiologischen pH gewöhnlich Zwitterinnen ist, da die Aminogruppe positiv geladen ist und die Carboxylgruppe negativ geladen ist, so dass das Ionisationsgleichgewicht ziemlich wichtig ist



Der isoelektrische Punkt ein spezifisches Merkmal eines Biomoleküls ist, das von jedem Molekül sein kann, das unterschiedlich geladen sein kann, so dass wir das auch in Bezug auf die Aminosäuren definieren werden.

Viele Proteine verwenden Aminosäuren, die nach der Proteinbiosynthese (nach dem so genannten Translationsprozess, der an den Ribosomen ((sind dies sehr große molekulare Maschinen innerhalb des Zytosols einer Zelle, in der die Proteinbiosynthese stattfindet)) stattfindet) modifiziert wurden, nennen wir sie post-translational modifizierte Aminosäuren, da die Modifikation nach der Translation stattfindet, also post-translational. Einige Beispiele für post-translational modifizierte Aminosäuren, 1. 4-Hydroxy-prolin 

Prolin (die aliphatische nichtpolare cyclische Aminosäure, bei der das Ende der Seitenkette, hier der terminale Kohlenstoff, mit der Aminogruppe des Rückgrats der Hauptkette durch eine kovalente Bindung verbunden ist), und dann das C4 oder in diesem Fall am C-Gamma-Atom eine Hydroxylgruppe durch Hydroxylierung hinzugefügt wird



Diese Hydroxylgruppe ist in der Lage, als Donor zu fungieren, um eine Wasserstoffbindung herzustellen,



diese Hydroxylgruppe kann also verwendet werden zur Stabilisierung großer länglicher Proteinstrukturen, wie z.B. Kollagen,



Also die Einführung von Hydroxylgruppen erhöht die Anzahl der Wasserstoffbrückenbindungen und damit erhöht die Stabilisierung von Proteinstrukturen, und deshalb ist Hydroxyprolin in einer großen Anzahl in Kollagen vorhanden. Dies gilt auch für 5-Hydroxyl-Lysin

1. 5-Hydroxy-Lysin 

Lysin (hat eine sehr verlängerte Seitenkette, sodass wir das C beta C gamma C delta C Epsilon haben, und schließlich haben wir die terminale Aminogruppe in der Seitenkette, und wir haben bei diesem C gamma eine zusätzliche Hydroxylgruppe, das ist das C5-Atom, also fünf Hydroxy-Lysin.



und das wird auch häufig im Kollagen gefunden, aus dem gleichen Grund wie bei Hydroxyprolin diskutiert wird, dass es in der Lage ist, mehr Wasserstoffbrückenbindungen zu etablieren und daher Kollagenstrukturen besser zu stabilisieren.

1. Gamma-Carboxy-glutamat 

Glutamat (hat eine saure Funktion in der Seitenkette, Carboxylgruppe, wir haben zwei Kohlenstoffe in der Seitenkette, sodass es C Beta und das C Gamma gibt) und an der C Gamma gibt es eine zusätzliche Carboxylgruppe, daher eine zusätzliche negative Ladung bei den physiologischen pH-Werten



Gamma-Carboxy-glutamat findet sich z.B. in Prothrombin (Blutgerinnungskaskade)



Die zusätzlichen negativen Ladungen werden verwendet, um das Molekül an positiven Ionen zu verankern, die an Zelloberflächen gebunden sind zu Lipid-Doppelschichten zu Membranen, sodass die elektrostatischen Wechselwirkungen aufgrund der Seitenkettenmodifikation erhöht werden, und dies ist wichtig für die Koagulation, da elektrostatische Wechselwirkungen erforderlich sind, um das Molekül an einer bestimmten Position im Blutgefäß zu fixieren, und dies erfolgt durch Carboxylierung der Seitenkette von Glutamat

1. Desmosin 

ist eine sehr komplexe post-translational modifizierte Aminosäure



ist ein Bestandteil des Elastins (Elastin ist ein großes Polymer der extrazellulären Matrix, also der Polymere, die unser Gewebe außerhalb der Zellen miteinander verbinden, und es ist von vier Lysinresten abgeleitet)



das Enzym Lysoloxidase umwandelt drei der Lysine in Aldehyde

1.



es handelt sich um eine Ringbildung, auf die die vierte Aminofunktion der Lysinreste und dies verbindet die Proteinketten im Elastinmolekül



Sie können identifizieren die Seitenketten von einem zwei- und dreimaligen Lysinrreste und der vierte enthält noch die Aminogruppe und wird aufgrund der Kondensationsreaktion über Aldehydzwischenprodukte ein Sechsring Heterocyclus mit einer positiven Ladung am Stickstoff-Desmosin gebildet

6-N-Methyl-Lysin 

Die post-translationale Modifikation, die hier stattfindet, ist die Methylierung



Die Methylierung spezifischer Lysinreste bestimmter Histone in sog. Nukleosom verändert die Bindung der umgebenden DNA an diese Histone, (Histone sind DNAbindende Proteine, die z.B. die DNA im Kern schützen und die DNA speichern, so dass die DNA sich um die Histone windet und daher nicht zu viel Platz für die Speicherung im Kern benötigt).



Wenn jedoch DNA im Replikationsprozess kopiert werden soll, muss die Bindung verändert werden und dies wird durch eine spezifische Methylierung der LysinSeitenkette dieser Histone kontrolliert



die Wirkung auf und die Bindung an die DNA ist auf einen sterischen Grund zurückzuführen, d.h. die Methylgruppe ist viel größer als der Wasserstoff, und daher ist die Bindung aus sterischen Gründen beeinträchtigt.

1. Selenocystein 

21. proteinogene Aminosäure,



eine Art Mischung, es gibt einen spezifischen Code im Genom für das Selenocystein, aber die Erzeugung findet sozusagen während der Translation statt,



es ist im Moment in etwa 30 eukaryotischen Proteinen vorhanden im aktiven Zentrum, also in der Glutathion-Peroxidase, z.B. Thioredoxin Reduktase, und kann an RedoxReaktionen beteiligt sein

Dies ist also nur, um Ihnen zu zeigen, dass eine Modifikation von Aminosäuren auch nach der Proteinbiosynthese stattfinden kann, und die prominentesten Mechanismen sind 1. die Hydroxylierung der Seitenketten zum Beispiel in Hydroxyprolin und Hydroxylysin 2. die Methylierung von Seitenketten zum Beispiel in Methyllysin 3. die Carboxylierung von Seitenketten zum Beispiel in Gamma-Carboxyglutamat

Green-fluorescent Protein GFP Zeigt ein weiteres Beispiel für die Modifikation von Aminosäureseitenketten nach der Proteinbiosynthese, so dass dieses Protein



besteht aus 238 Aminosäuren



hat ein Molekulargewicht von etwa 27 Kilo-Dalton, was 27 tausend Dalton bedeutet, was Gramm pro Mol bedeutet,



es zeigt eine hellgrüne Fluoreszenz, wenn es Licht im blauen bis ultravioletten Bereich ausgesetzt wird



der Anregungspeak liegt bei einer Wellenlänge von 395 nm, aber der Emissionspeak liegt bei 509 nm, was im unteren grünen Bereich von dem sichtbaren Spektrum



wie es funktioniert, Sie können links erkennen, dass das Protein eine so genannte β-barrel Struktur bildet, es ist also eine Art Käfig, und innerhalb dieses Käfigs drei Aminosäuren SerinTyrosin und Cystein reagieren in Gegenwart von Sauerstoff miteinander, um ein heterozyklisches System zu bilden, das auf das spezifische Fluoreszenzverhalten zurückzuführen ist



durch diese chemische Reaktion in Gegenwart von Sauerstoff diese drei Aminosäuren bilden einen sog. Chromophor, und dieser Chromophor kann bei 395 nm zur Fluoreszenzemission bei 509 nm angeregt werden



so entsteht der Fünfring Heterocyclus,



der Farbcode sollte Ihnen zeigen, dass Teile dieser Ringstruktur vom Tyrosin stammen ein anderer Teil vom Serin in diesem Fall ist nicht die Seitenkette des Serins beteiligt und auch nicht die Seitenkette des Tyrosins, es ist sowohl die Hauptkette, als auch die Hauptkette des Glycins, die nur einen der Stickstoffatome dieses Heterocyclus liefert



diese sehr spezifische Form der post-translationalen Modifikation, bei der Aminosäuren aufgrund ihrer spezifischen Konformation miteinander reagieren, wird auch Reifung genannt,



Also das Protein wird durch Biosynthese hergestellt, dann zeigen die Aminosäuren (dieses Beispiel β-barrel Struktur von GFP ) eine spezifische Konformation, bei der sie dazu neigen, in Gegenwart von Sauerstoff zu reagieren, um das Chromophor zu bilden, so dass sie reifen, um das endgültige Chromophor zu bilden, das z.B. in Quallen natürlich vorkommt



Also GFP ist der Grund dafür, dass spezifische Quallen diese grünen bis blaue Floreszenzen zeigen

GFP 

ist auch für die Biotechnologie sehr wichtig, da diese Floreszenzen ganz spezifisch angeregt werden können und die Fluoreszenz auf eine recht einfache Weise aufgezeichnet werden kann.



GFP-tagged-Proteins werden beispielsweise zur Lokalisierung von Tagged Proteine in bestimmten Zellkompartimenten verwendet, d.h. wenn Sie wissen wollen, wohin das interessierende Protein innerhalb der Zelle transportiert wird, können Sie Ihr interessierendes Protein mit GFP fusionieren, indem Biotechnologie, dann kann man die Zelle zwingen, dieses Fusionsprotein zu produzieren, und man kann die lebende Zelle mit den spezifischen Wellenlängen anregen, um die spezifische GFP-Fluoreszenz zu detektieren, und wie in den Beispielen auf der rechten Seite gezeigt erkennen, dass das Tagged Protein in einer bestimmten Zelle lokalisiert ist Organellen, die ziemlich rundlich sind, wie Sie hier sehen können, so dass es nicht vollständig in einer Zelle verteilt ist, es ist nicht im Kern, also ist dies

der Kern, der frei von dem Protein ist, wie wir sagen können, und in diesem Fall ist es das endoplasmatische Retikulum, wohin das Protein transportiert wird und das wir übrigens durch die spezifische Fluoreszenz des Fusionsproteins identifizieren konnten.



Seien Sie nicht verwirrt, in diesem Fall ist es ein modifiziertes GFP, es ist EYFP, also zeigt dies eine gelbe Fluoreszenz, aber das Prinzip ist fast das gleiche, nur dass eine Aminosäure ausgetauscht wird und daher die Reifung verschiedene Aminosäuren beinhaltet und daher das Fluoreszenzspektrum ein wenig verändert ist und daher kann man gelbe Fluoreszenz erkennen, wenn man also eine 3D-Projektion hat, die sich auf der rechten Seite befindet, und man kann eine Idee im 3D-Raum haben, wo das Protein in dieser Zelle lokalisiert ist.



Und unten gibt es ein weiteres Beispiel in diesem Fall ist EGFP, das biotechnologisch durch Biotechnologie modifiziert wurde, um eine verbesserte Fluoreszenz zu zeigen, so dass einige Aminosäuren ausgetauscht wurden und dies zeigt eine grüne Fluoreszenz wie das ursprüngliche GFP und man kann die Fluoreszenzproteine Diffusionsproteine leicht erkennen, wenn man nur helles Licht mikroskopiert, wie in der Mitte gezeigt, kann man die Zellen einfach identifizieren, aber wenn man die spezifische Fluoreszenz von EGFP anregt und die Überlagerung durchführt wie auf der rechten Seite gezeigt, können Sie erkennen, dass das Protein direkt außerhalb des Zellkerns wieder in kleinen zellulären Kompartimenten ist, die nicht so sind, als wäre es nicht gleichmäßig verteilt. W



as Sie also von diesem Objektträger lernen sollten, ist das grüne Fluoreszenzprotein und seine anderen Formen, z.B. das YFP, das gelbe Fluoreszenzprotein, und einige andere sind sehr wichtige Werkzeuge für die Biotechnologie, wenn Sie es verwendet haben, um Proteine anzuvisieren, können Sie die spezifische Fluoreszenz zum Nachweis von Proteinen z.B. in lebenden Zellen verwenden.

Aminosäuren kommen nicht nur in Proteinen vor! Nicht-proteinogen Aminosäuren 

Aminosäuren, die in einigen Stoffwechselwegen vorkommen,



sie können auch Teil von Peptiden sein, die oft ein zyklisches Verhalten oder eine zyklische Struktur aufweisen, und diese Peptide werden nicht von Ribosomen synthetisiert



können auch in D-Konfiguration auftreten, und wir befinden uns in der L-Welt der Proteine und Enzyme,



d.h. alle Aminosäuren, die Teil von Proteinen und Enzymen sind, sind in L-Konfiguration, aber nicht-proteinogene Aminosäuren können auch in D-Konfiguration auftreten D-konfiguration



sie sind wichtige Bestandteile von Stoffwechselwegen und zyklischen Peptiden zum Beispiel, und wir werden uns einige Beispiele ansehen

Ornithin



ist ein Produkt eines Enzyms im Harnstoffzyklus



es ist das Produkt des Enzyms Arginase



wenn Sie genau hinsehen, werden Sie feststellen, dass Ornithin dem Lysin recht ähnlich ist, so dass wir eine verlängerte Seitenkette haben, jedoch eine CH2-Gruppe fehlt, so dass wir nur dieses C beta haben, das C gamma und C delta, das C epsilon fehlt, und dann haben wir die geladene Aminogruppe

Citrullin 

stammt ebenfalls aus dem Harnstoffzyklus,



wird aus Ornithin hergestellt, so dass dieser Teil des Citrullinmoleküls, wie oben gezeigt, von Ornithin stammt, so dass wir hier die drei CH2-Gruppen haben und dieses mit CarbamoylPhosphat reagiert, dieser Teil bildet die kovalente Bindung und damit bildet Citrullin

Die Reaktion zwischen Ornithin und Carbamoyl-Phosphat 

ist eine der zentralen Reaktionen im Harnstoffzyklus, so dass Ornithin und Citrullin zwei nicht-proteinogene Aminosäuren sind, die als Stoffwechselzwischenprodukte im Harnstoffzyklus gefunden werden können.

Nicht alle Aminosäuren in Proteinen enthalten sein müssen, dass es neben den post-translational modifizierten, die ebenfalls Teil der Proteine sind, auch nicht-proteinogene gibt. 1. Einführung der 21 proteinogenen Aminosäuren 2. Die Möglichkeiten der post-translationalen Modifikationen der proteinogenen Aminosäuren 3. Die kurze Einführung in nicht-proteinogene Aminosäuren, die auch bei der D-Konfiguration auftreten können und die an Peptiden beteiligt sein können, die nicht von Ribosomen synthetisiert wurden 4. wir werden nun mit weiteren Eigenschaften der Aminosäuren fortfahren und dies ist die Ionisationsbilanz und auch die Berechnung des isoelektrischen Punkts

Die Henderson-Hasselbalch-Gleichung 

Diese Gleichung kann auch als Puffergleichung bezeichnet werden



beschreibt die Beziehung zwischen dem pH-Wert der Lösung und dem Gleichgewicht einer Säure-Base-Reaktion



BH+ ist die Säure; B ist die korrespondierende Base,



wie Sie sehen können, die Henderson-Hasselbalch-Gleichung kann zur Abschätzung des pH einer Pufferlösung verwendet werden.



ist die thermodynamische Gleichgewichtskonstante K dieser Reaktion; Ks nichts anderes als die Konzentration der Protonen H+ und der Base B geteilt durch die Konzentration des Substrats in diesem Fall ist BH+ also die Säure



der pH-Wert einer Pufferlösung hängt von der Dissoziationskonstante der Säure und dem dekadischen Logarithmus der Basenkonzentration geteilt durch die Säurekonzentration ab



wenn die Konzentration der Base und der Säure in der Lösung gleich ist, dann fällt in eins und dekadische Logarithmus von eins ist null, so haben wir pH gleich pKs.



das heißt, der pH-Wert der Lösung entspricht dem pKs-Wert dieser Säure



in umgekehrter Richtung: wenn die Konzentration der Base im Vergleich zur Säure um das Zehnfache erhöht ist, dann hätten wir die Zahl 10 in Klammern, der neg und der dekadische Logarithmus von 10 ist eins, so dass in diesem Fall der pH-Wert gleich dem pKs-Wert der Säure +1 ist



Wenn die Säurekonzentration eine tausendfache Erhöhung ist im Vergleich zur Basiskonzentration haben wir dann Punkt 0.001 in Klammern, und der dekadische Logarithmus ist 10-3, so dass pH gleich dem pKs-Wert der Säure -3, weil der dekadische Logarithmus von 10-3 = -3 ist, so dass pH gleich pKs -3 ist.

Isolierte Aminosäuren zeigen ein Zwitter-ionisches Verhalten 

d.h. je nach pH können Aminosäuren den Protonierungszustand zumindest an der Carboxylgruppe am C-Terminus oder an der Aminogruppe am N-Terminus



einige Aminosäuren können auch ihren Protonierungszustand in der Seitenkette ändern, der Rest



wenn wir einen Blick auf die pH-Abhängigkeit des Protonierungszustands der Aminosäure werfen, wie auf dieser Folie gezeigt



wenn wir bei pH 0 beginnen und den pH-Wert zuerst erhöhen↑ wird jede Gruppe protoniert, d.h. die Carboxylgruppe protoniert wird, wird auch die Aminogruppe protoniert, und vielleicht werden auch dissoziierbare Gruppen in der Seitenkette protoniert,



Und dann erhöhen wir den pH-Wert↑ so dass die erste Gruppe, die deprotoniert, die Carboxylgruppe ist, so dass hier eine negative Ladung auftritt, was bedeutet, dass die vollständig protonierte Form abnimmt ↓, während die sog. Zwitterionische Form zunimmt ↑



Die Zwitterionische Form wird hier in der Mitte in blau gezeigt



Und wenn wir den pH-Wert weiter erhöhen ↑ dann schließlich wird die Aminogruppe deprotoniert, was bedeutet, dass die Zwitterionische Form nimmt wieder ab ↓ und die Form, die beide Gruppen, die Amino- und die Carboxylgruppe, im deprotonierten Zustand enthält, zunimmt↑ und dann gibt es eine einzige negative Ladung



Das bedeutet, dass jede Aminosäure in einem isolierten Zustand ihren Protonierungszustand und ihre Ladung ändert in Abhängigkeit: Von den pH-Wert von einer einzelnen positiven Ladung bei sehr saurem pH-Wert → über den Zwitterionische Zustand, in dem die Nettoladung null ist (wenn es in der Seitenkette keine weitere Gruppe gibt, die protoniert oder deprotoniert werden kann) → zu einer einzelnen negativen Ladung bei sehr basischem pH-Wert.



Also dies gilt für alle Aminosäuren im isolierten Zustand, wenn die Seitenkette jedoch auch so als dissoziierbare Gruppe bezeichnet, die protoniert oder deprotoniert werden kann, könnte sie sich ändern, weil es dann eine andere Gruppe für die Protonierung oder Deprotonierung gibt.

Titrationskurve von Glycin



Sie sehen eine Titrationskurve von Glycin, die einfachste Aminosäure, weil es nur einen Wasserstoff in der Seitenkette gibt



Also das Diagramm zeigt die Anzahl der Hydroxyläquivalente, die in der Umgebung bereitgestellt werden, d.h. die Änderung der Konzentration der Hydroxylgruppen auf der XAchse und die damit verbundene Änderung des pH-Wertes der Glycinlösung auf der YAchse.



Also wir der können schrittweisen Deprotonierung von Glycin folgen, bedeutet die schrittweise Deprotonierung der Carboxyl- und der Aminogruppe,



wie wir gerade gesagt haben, bei stark sauren Bedingungen, dass bei einem pH-Wert von Null alle Gruppen protoniert sind, was bedeutet, dass wir den Wasserstoff hier an der Carboxylgruppe haben, die protoniert ist, und wir haben die protonierte Aminogruppe



Also wir fügen dann OH- Hydroxylionen hinzu, so ändert sich der pH-Wert in basischere pH wie Sie hier sehen können, dass er anfängt, basischer zu werden



Dieser...