Libro de prácticas microbiología . ICSE Laboratorio clínico y biomédico PDF

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Libro de prácticas microbiología . ICSE Laboratorio clínico y biomédico....

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Libro de prácticas microbiología 2 año Laboratorio clínico y biomédico a distancia

Astrit Samantha Levano Correa

Contenido: Prácticas realizadas a lo largo del curso de microbiología clínica. En este cuaderno se va a detallar con mayor profundidad el estudio de microorganismos y las diferentes técnicas para favorecer el desarrollo de un microorganismo además de aprender a visualizarlos con diferentes tinciones o a simple vista.

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Índice PRÁCTICA 1 .Observación de bacterias del yogur en fresco. Introducción Objetivos Materiales Procedimiento Conclusiones Recomendaciones Resultados e interpretación

PRÁCTICA 2 . Elaboración de un medio de cultivo Introducción Objetivos Materiales Procedimiento Resultados e interpretación

PRÁCTICA 3 . Morfología de colonias bacterianas

4 4 5 5 5 6 6 6

6 6 7 7 7 9

9

Forma en el plano transversal Borde Superficie

9 10 12

Elevación

13

PRÁCTICA 4. Prueba de la catalasa y técnicas de siembra Técnicas de siembra introducción Objetivo Materiales Prueba de la catalasa Introducción Objetivo Materiales Procedimiento Primera parte de la práctica Resultados e interpretación Segunda parte de la práctica Resultados e interpretación

PRÁCTICA 5. Cultivo a partir de muestra de huevo Introducción Objetivo Materiales Resultados e interpretación

14 14 14 15 15 15 15 15 15 16 16 16 16 17

17 17 18 18 20

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PRÁCTICA 6. Visualización de hongos Introducción Objetivos Materiales Procedimiento Primera parte Segunda parte :Tinción de Gram en el hongo Rhizopus. Resultados e interpretación Primera parte Segunda parte

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Conclusiones y opinión personal

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Bibliografía

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PRÁCTICA 1 .Observación de bacterias del yogur en fresco.

Introducción El yogur es un alimento producido por la acidificación bacteriana llevada a cabo sobre la leche. A nivel industrial, tras el acondicionamiento de la misma (eliminación del exceso de grasa y suplementación) se procede con la pasteurización. Finalizado el proceso, se enfría rápidamente hasta la temperatura de 40ºC y se inocula con diferentes cepas bacterianas de Lactobacillus delbrueckii sup. bulgaricus y Streptococcus thermophilus. La acción fermentativa de estas especies bacterianas sobre el azúcar de la leche

la lactosa, condiciona la producción de ácido láctico como producto final (Figura anterior). El descenso de pH provoca la desnaturalización y la consiguiente precipitación de las proteínas de la leche, la lactoalbúmina y la caseína, dando el aspecto endurecido y característico al alimento. Es importante también mencionar el colorante azul de metileno ya que lo usaremos para hacer más visible la estructura de la célula.

Objetivos Identificar el tipo de células presentes en el yogurt, además de comprender el

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funcionamiento del microscopio óptico y aplicar técnicas adecuadas para desarrollar una adecuada práctica.

Materiales Azul de metileno. Alcohol 96º. Yogur natural. Pipeta Pasteur. Mechero bunsen. Portaobjetos y cubreobjetos. Microscopio óptico. Asa de siembra, mondadientes o hisopo. Agua destilada. Pinzas de madera Papel de filtro Aceite de inmersión

Procedimiento 1. Nos ponemos la bata , los EPIS y procedemos a la desinfección de manos además de la zona de trabajo 2. Recoger los materiales necesarios para realizar la práctica. 3. Encendemos el mechero bunsen y esterilizamos el asa de siembra. 4. Introducimos el asa de siembra en el yogur por un lado y luego ya procedemos a 5. Cogemos una pequeña muestra de yogur. 6. Hacemos un frotis de la muestra en el portaobjetos 7. Secamos la muestra(con la ayuda de las pinzas) en el mechero bunsen que previamente hemos encendido 8. Marcamos la muestra y ponemos la fecha 9. Rompemos la membrana plasmática con unas cuantas gotitas de alcohol 96ºC 10. Dejamos secar la muestra 11. Añadimos 1 o 2 gotas de azul de metileno y esperamos 5 minutos. 12. Lavamos la muestra para eliminar el exceso de azul de metileno, le colocamos un cubreobjetos 13. observamos en el microscopio desde el más bajo al más alto, hasta poder divisar la muestra.

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Conclusiones Identificamos las células presentes en el yogurt, concluyendo que son células procariotas, debido a la ausencia de núcleo Realizamos un correcto uso del microscopio, asimismo la utilización adecuada de los diferentes lentes de aumento. Aplicamos las técnicas correctas en la práctica, de esa manera logramos observar las células en el microscopio sin problemas.

Recomendaciones Debemos tener cuidado al manipular el microscopio, para trasladarlo debemos tomarlo de la base y el brazo. Al momento de ubicar las gotas de la mezcla de yogur, debemos tomar el portaobjetos por los bordes, para evitar contaminación. Para realizar correctamente la práctica debemos prestar atención a las recomendaciones del docente.

Resultados e interpretación Se visualiza movimiento en la muestra pero con dificultad. Logramos ver Bacilos y cocos PRÁCTICA 2 . Elaboración de un medio de cultivo

Introducción Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. La diversidad metabólica de los microorganismos es muy amplia; por ello, la variedad de medios de cultivo es también muy grande, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. Los medios de cultivo pueden ser sólidos o líquidos. La composición de estos medios puede ser definida (medio sintético) o no definida (medio complejo). No todos los medios de cultivo son iguales, ni todos los microorganismos pueden crecer en todos los medios de cultivo. 6

AGAR: Se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. El componente predominante en el agar bacteriológico es un polisacárido al que acompañan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Un gel de agar al 1-2 % en agua licua hacia los 100°C y se gelifica alrededor de los 40°C, dependiendo de su grado de pureza. Con la excepción de algunos microorganismos marinos, el agar no es empleado como nutriente por las bacterias.

Objetivos Comprender que los medios de cultivo tienen requerimientos nutricionales que favorecen el desarrollo de los microorganismos y establecer la esterilidad en un medio para favorecer la obtención y diagnóstico del microorganismo o microorganismos a estudiar.

Materiales Balanza. Papel de platina o vidrio de reloj. Papel de filtro. Matraz erlenmeyer. Algodón. Placa de Petri. Autoclave. Agar. Agua destilada.

Procedimiento 1. Nos ponemos la bata , los EPIS y procedemos a la desinfección de manos además de la zona de trabajo 2. Recoger los materiales necesarios para realizar la práctica. 3. Realizamos los cálculos correspondientes según el Agar que vayamos a usar en nuestro caso fue Agar MRS bruth y por lo tanto nuestros cálculos son : 55.2 gr de cultivo de lactobacillus ---- 1000 ml x gr de cultivo ---- 100 ml x= 5.52 gr en 100 ml de agua destilada 4. Calibramos la báscula para ser lo más preciso posible.

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5. Ponemos el vidrio de reloj y taramos 6. Pesamos los 5,52 gramos de cultivo con la espátula.

7. Ponemos el soluto en el matraz Erlenmeyer de 100 ml. No ponemos los 100 ml de agua destilada de golpe para poder retirar los restos de soluto con el sobrante de agua destilada hasta llegar a los 100 ml.

8. Disolvemos en el agitador magnético con la ayuda del imán a 100 grados a 700 rpm 9. Retiramos el imán con la espátula de metal 10. Ponemos algodón y cubrimos con papel de aluminio 11. El matraz pasa al autoclave a 121 grados a 15 minutos

12. Dividimos el líquido en dos placas de Petri. Poniendo la fecha y nuestro nombre para poder identificarlo posteriormente. 13. Esperamos 24 horas como mínimo para que el líquido se haya vuelto sólido y podamos usar este medio de cultivo

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Resultados e interpretación El primer medio de cultivo que realizamos no se pudo llegar a solidificar ya que el autoclave no funcionaba. En el segundo medio de cultivo el medio estaba correctamente preparado por lo que lo pudimos usar para una posterior práctica. PRÁCTICA 3 . Morfología de colonias bacterianas

Forma en el plano transversal Forma

Definición

Puntiforme

Aquellas que crecen como pequeños agregados de puntos cercanos entre sí.

Circulares

Dibujo

Ejemplo

Colonias de Bacillus spp

son colonias muy uniformes, completamente redondas. Colonias de Staphylococcus aureus

Filamentosas

Irregulares

Las colonias crecen como filamentos que se proyectan desde una región central o núcleo.

Colonias de hongos filamentosos

esas colonias que no tienen formas definidas y que son más bien amorfas. Colonias de Bacillus sp

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Rizoides

Como su nombre lo indica, estas colonias crecen de forma semejante a las raíces de una planta. Bacillus subtilis

Fusiforme

Aquellas colonias que presentan una forma alargada, como si se tratase de una elipse cuyos bordes han sido estirados longitudinalmente.

Colonias de Bacillus sp

Borde ondulado

Colonias que presentan pequeñas fenestraciones característicos de los bacilos largos como Bacillus anthracis

Liso

Son homogéneas en todo su recorrido

Proteus vulgaris o Escherichia coli

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lobulado (borde con entradas y salidas)

Son colonias que poseen los bordes curvos de manera irregular, suelen tener la apariencia de huevo estrellado. Yersinia pestis

rugoso

Presentan un borde rugoso.

Streptococcus pneumoniae

Superficie Lisa

Se observa una forma sin ondulaciones streptococcus pneumoniae

Estriada

Se observa en forma espinada o en forma de estrías en la colonia

Proteus mirabilis

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Amorfa

sin forma determinada

Gordonia araii Granular

Colonias de textura en forma granular

Streptococcus mitis Brillante

color reluciente

Serratia marcescens Mate

color mate o opaco

Staphylococcus aureus

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Elevación Plana

las que tienen poca o ninguna elevación.

Streptococcus pneumoniae umbilicada

Colonias con dos elevaciones y excavación central

p.gingivalis Convexas

Se elevan más notoriamente en el centro, pero cuyos márgenes permanecen más bien adosados a la superficie. Staphylococcus aureus

plano convexa

Colonias con elevación intermedia

klebsiella pneumoniae Papilar

Colonias con elevación y punta

Streptococcus agalactiae

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Acuminada

Colonias con elevación cultivo de serratia marcescens

PRÁCTICA 4. Prueba de la catalasa y técnicas de siembra Técnicas de siembra introducción Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y multiplicación. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento.

Objetivo Identificar y conocer las diferentes técnicas de siembra

Materiales Papel de filtro. Mechero Bunsen Asa de siembra Mecheros tubo con catalasa medio de cultivo sólido

Prueba de la catalasa Introducción La catalasa es una enzima que se encuentra en la mayoría de los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos. Se encuentra normalmente junto a la cromoxidasa y es la responsable del desdoble del H2O2. El agua oxigenada es uno de los productos de la degradación de los hidratos de carbono y es tóxico para nuestro organismo. Motivo por el que los hematíes poseen la enzima catalasa.

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Se pone en contacto el microorganismo problema con agua oxigenada. Si se desdobla y aparece O2 el microorganismo es catalasa positivo. El resultado es visible porque en caso de positividad aparecen burbujas fácilmente identificables.

Objetivo Comprobar si un microorganismo problema posee la enzima catalasa.

Materiales Papel de filtro. Agua oxigenada Porta Mechero Bunsen Asa de siembra Mecheros tubo con catalasa Listeria agar selective base Cubeta azul de metileno

Procedimiento Primera parte de la práctica 1. Nos ponemos la bata , los EPIS y procedemos a la desinfección de manos además de la zona de trabajo 2. Recoger los materiales necesarios para realizar la práctica. 3. Encendemos el mechero Bunsen 4. Calentamos el asa de siembra hasta que esté al rojo vivo 5. sin dejar el asa de siembra abrimos el tubo con el meñique Y lo esterilizamos Dejando pasar el tubo tres veces por el Mechero Bunsen 6. Con la ayuda de la siembra cogemos la muestra del fondo del tubo y volvemos a esterilizar el tubo 7. Colocamos en el porta una alícuota de suero láctico

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8. Ponemos una gota de agua oxigenada

Resultados e interpretación Con la primera muestra no se producen burbujas por lo que es catalasa negativa. Con la segunda cogimos una pequeña muestra de un cultivo de listeria selective (agar base) con el mismo procedimiento mencionado anteriormente. En este caso se produjeron burbujas por lo que sería catalasa positiva

Segunda parte de la práctica 1. Ponemos una gota de agua destilada sobre el portaobjetos 2. Esterilizamos el asa de siembra como ya he mencionado antes con el mechero Bunsen 3. Con el asa de siembra realizamos una extensión del medio de cultivo sólido con listeria en agar base 4. Secamos la muestra con la ayuda del mechero Bunsen Sin quemar el microorganismo 5. En la cubeta de tinción le ponemos 2 gotas de azul de metileno

6. Esperamos 5 minutos 7. Retiramos el exceso con agua destilada 8. Observamos al microscopio

Resultados e interpretación

Se observan muchos cocos es decir es una bacteria.

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PRÁCTICA 5. Cultivo a partir de muestra de huevo Introducción El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Son bacilos gram negativos, anaerobios facultativos, no formadores de esporas, generalmente móviles por flagelos perítricos (excepto S. gallinarum). Fermentan glucosa, maltosa y manitol, pero no fermentan lactosa ni sacarosa. Son generalmente catalasa positiva, oxidasa negativa y reducen nitratos a nitritos. nos desinfectamos las manos Además de la zona de trabajo y nos ponemos los EPIs Encendemos el mechero Bunsen y utilizamos el asa de siembra Retiramos el lazo de siempre de un mechero cuando esté al rojo vivo y metemos la punta por un extremo del medio de cultivo

Objetivo Identificar salmonella

Materiales ★ Mechero Bunsen. ★ Huevo. ★ Vaso de precipitado. ★ Asa de siembra. ★ Medio de cultivo Listeria. ★ Fósforos. ★ Placa de Petri. ★ Papel de filtro. ★ Estufa

PROCEDIMIENTO 17

1. 2. 3. 4. 5.

Colocarse la bata, lavarse las manos y ponerse los guantes. Cogemos el material necesario para realizar la práctica. Encendemos el mechero Bunsen Calentamos el asa de siembra hasta que esté al rojo vivo cogemos un poco de muestra del huevo del vaso de precipitado (Siempre dejando enfriar el asa de siembra por un lado ) 6. Procederemos a coger una muestra de la Yema o clara (sin ser la zona donde enfriamos el asa de siembra)

7. En el cultivo sólido realizamos las técnicas de estrías o zig-zag 8. Volvemos a esterilizar el asa de siembra 9. Repetimos el procedimiento las veces que haga falta 10. Identificamos la muestra 11. Lo metemos a la estufa de cultivo incu-Line boca abajo para evitar la condensación y contaminación por las gotitas , a 37ºC. 12. Esperar 24-48h. ACTIVIDADES 1.

¿Qué géneros bacterianos podemos encontrar en muestras de huevo? La más importante es Salmonella, y en algunos casos Listeria, Escherichia coli y Enterobacter.

2.

De los tipos de agar que hay presentes en el laboratorio ¿Cuál de ellos permitiría el crecimiento de alguno de los géneros bacterianos de la anterior pregunta? -

Listeria: Agar selectivo de listeria.

-

Salmonella: Agar rojo violeta de glucosa, agar shigella y agar no selectivo.

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3.

Si observamos colonias en nuestro medio de cultivo ¿Cómo debería ser la morfología de las mismas según el género bacteriano? En colonias de salmonella se observan colonias verdes claras y precipitados negros por la producción de sulfuro de hidrogeno.

4.

Basándote en los géneros bacterianos de la primera cuestión ¿Qué pruebas bioquímicas realizarías para corroborar tu diagnóstico?¿Y serológicas?¿Y moleculares? Las pruebas bioquímicas serían: Prueba de catalasa. Las pruebas serológicas serían: Prueba de aglutinación. Las pruebas moleculares: PCR para el diagnóstico y coprocultivo. Se analizan las heces del paciente para poder aislar la salmonella, también se puede optar por un frotis rectal aunque se prefiere el primer método.

5.

¿Podría crecer en un medio de cultivo selectivo un microorganismo diferente al que está destinado el cultivo?

Sí , por contaminación, por error humano, por no utilizar los reactivos que se querían usar realmente o por estar los reactivos caducados.

Resultados e interpretación No se observan colonias verdes claras y precipitados negros por la producción de sulfuro de hidrogeno por lo que es negativo a salmonella . Como se aprecia en la imagen sólo aparecen dos colores identificables a simple vista , el de la yema y la clara con colores brillantes. Podemos observar que ha crecido algo pero no tiene pinta de ser crecimiento bacteriano y para averiguar con mayor certeza necesitamos seguir realizando pruebas.

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PRÁCTICA 6. Visualización de hongos Introducción El moho del pan, Rhizopus nigricans, es un hongo zigomiceto cuyo aparato vegetativo (reproducción) es un micelio blanco y sedoso, constituido por hifas no tabicadas(hifas cinocíticas). La hifa es un filamento tubular que forma la unidad estructural de los hongos pluricelulares. El conjunto de hifas constituye el micelio. Poseen reproducción asexual mediante esporas adaptadas a la diseminación por el aire(aplanosporas), que se forman en unos órganos reproductores llamados esporangios, situados en el extremo de las hifas. Cuando están maduros presentan un color negruzco. Pueden tener reproducción sexual (unión de gametangios). Su forma de vida es saprobióntica, es decir, vive sobre materia orgánica a la que ataca enzimáticamente para absorber después los nutrientes necesarios.

Objetivos Observar la estructura de un hongo y demostrar que bajo ciertas condiciones en el pan o en otros alimentos crecen hongos.

Materiales Microscopio Portaobjeto y cubreobjeto Muestra de pan con moho. Espátula 20

Tinción de GRAM Alcohol 96º Cubeta Cronómetro. Cristal violeta Safranina Muestra de hongo Rhizopus. Lugol Pipeta Pasteur Agua destilada Asa de siembra

Procedimiento Primera parte 1. Cogemos la muestra con una espátula. 2. Colocamos en el portaobjeto, cubrimos con el cubreobjetos sin dejar ni una burbuja de aire 3. Observamos en el microscopio.

Segunda parte :Tinción de Gram en el hongo Rhizopus. 1. Nos ponemos los Epis , coger los materiales necesarios y desinfectamos 2. Ponemos una gota de agua destilada en el porta. 3. Encender el mechero bunsen y luego esterilizar el asa de siembra c...