Materiales y Examen de prácticas Microbiología PDF

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EXAMEN PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AISLAMIENTO DE MICROORGANISMO AÉREOS MEDIO DE AGAR COMÚN Fuente de hidrógeno, fuente de carbono y sales minerales. Muy permisivo ya que permite el crecimiento de muchas especies. MEDIO DE AGAR SABOURAUD Medio selectivo para el crecimiento de hongos por la presencia de mucosa y grandes cantidades de azúcar. Tiene un pH bajo y, por tanto, muy rico para los hongos y algunas bacterias determinadas. Estos cultivos se conservan a 28º-30º C, ya que es una temperatura cercana a la del aire del ambiente. Para los microorganismos que crecen en el aire esta sería el medio perfecto. En cambio, si fueran de interés clínico, la temperatura de cultivo sería de unos 37º-38ºC.

MICROORGANISMOS SUPERFICALES AZOTOBACTER Bacteria fijadora de N2. Esta fijación es realizada por microorganismos eucarióticos (bacterias libres o simbióticas). Azotobacter es una bacteria que se encuentra fijada al suelo, no está libre. Estas, necesitan un medio rico en oligoelementos, un medio selectivo sin fuente de nitrógeno con precipitado. Es aerobio estricto y tiene la capacidad de formar vesículas de gas que flotan en el medio. Forma cistos, que no son resistentes al hervido, aunque contienen receptores de resistencia. La única bacteria resistente al calor es el Bacillus. El procedimiento para su cultivo debe tener unas condiciones de esteliridad (con bacterias de tamaño 0.2um=micras). Para comenzar, encenderíamos un mechero Bunsen para estelirizar la zona. Añadimos una muestra de tierra (aún sin estelirizar) de 5 gramos en el medio sin nitrógeno. Al dejar incubar la muestra a 30ºC, crecerían bacterias aerobias y fijadoras de N2. Azotobacter crecerá en la superficie de la muestra, en forma de película. En un segundo cultivo, esta vez sin agitación, se siembra por agotamiento en el mismo medio selectivo pero esta vez con agar, para que sea sólido. Se tiñe con tinción gran y su forma es de bacilo. AISLAMIENTO DE UNA BACTERIA DETERMINADA SUSPENDIDAS EN UN LÍQUIDO O EN MEDIO SÓLIDO EN UN MEDIO CON DIVERSIDAD DE BACTERIAS Existen dos técnicas 

Aislamiento por dilución: Consiste en realizar diluciones sucesivas de la muestra en condiciones de esterilidad, de manera que se va reduciendo el número de microorganismos de la suspensión inicial, con el objeto de sembrar después cantidades conocidas de las diluciones en placas de Petri.

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Aislamiento de siembra por estrías: se utiliza un raspador (asa de siembra) con un extremo de tungsteno que se esteriliza con mechero Bunsen. Con el asa cogemos una muestra y hacemos una siembra en un extremo de la placa. Se vuelve a esterilizar, y

dibujamos unas estrías en la placa desde el punto de cultivo de la bacteria. Se esteriliza de nuevo, y se vuelven a dibujar estrías perpendiculares a las que ya hemos realizado. Este proceso se repite dos veces más hasta formar un cuadrado de estrías que alcancen el origen donde sembramos la bacteria, sin llegar a tocarlo. Bacterias para aislar: o o o o o

Pseudomonas aeruginosa (productor de pioverdina, sideóforo que se cultiva en un medio F con poco hierro ya que son capaces de sintetizarlo) Escherichia coli (enterobacteria, no resiste ni calor ni lugol) Salmonella spp (enterobacteria…) Klebsiella pneumoniae (enterobacteria…) Bacillus (gran – formador de endosporas resistentes al calor y al lugol)

Para las enterobacterias el cultivo se realiza en un medio selectivo de gliceroles en nevera, conocido como Agar EMB, medio para Escherichia, Salmonella y Klebsiella (generalmente son Gram -) con marcación de eosina y azul de metileno. El agar EMB es rico en lactosa, y algunas bacterias la utilizan parar virar el colorante a verde metálico, como Escherichia. El Bacillus se cultiva en agar común (no selectivo). Por tanto, si se presenta un medio de color verde metálico, la lactosa estará siendo utilizada por el organismo. En el caso de Pseudomonas se utiliza el medio King B no selectivo que permite la detección de la síntesis de pioverdina. Las bacterias que se cultivan en este medio sintetizan proteínas que se unen al hierro, como es la pioverdina. Con este medio podremos determinar si una Pseudomonas es patógena o no, ya que la pioverdina es un factor de virulencia, aquellas cepas que la sinteticen, serán patógenas.

TINCIÓN DE GRAM La tinción de Gram es un tipo de tinción que se realiza sobre las bacterias para observarlas mejor bajo el microscopio. Según la distribución del peptidoglicano de la pared celular que las envuelve, se tiñen de una forma u otra. Así, las bacterias que no se tiñen mediante esta técnica se denominan Gram negativas. Están formadas por una pared más fina formada por menos capas de peptidoglicano y una segunda membrana rica en lípidos (que repele la tinción Gram), al microscopio aparecen incoloras. Las Gram positivas tienen una pared celular mucho más gruesa, formada por un gran número de capas de peptidoglicanos entre las que se inserta la tinción Gram, dando un color violeta intenso al microscopio y se clasifican como Gram +. El proceso es muy sencillo, y los pasos a seguir serían:

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Recoger la muestra de bacterias a estudio mediante un isopo (bastón estéril de algodón). Extender dicha muestra sobre un portaobjetos y dejarla secar. Fijar la muestra mediante un alcohol (metanol). Aplicar el tinte de violeta de genciana sobre el portaobjetos y esperar un minuto. Enjuagar la muestra con agua y aplicar un fijador del violeta de genciana (lugol). El lugol y el violeta de genciana forman un complejo insoluble en agua capaz de penetrar en la pared de las células bacterianas.

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Lavar de nuevo el portaobjetos con una mezcla de alcohol y acetona durante unos segundos. Opcionalmente se puede añadir una tinción de safranina o fucsina para distinguir las gram negativas que aparecerán bajo el microscopio (en lugar de incoloras) con un tono rosado o rojo. Lavar con agua. Ya se puede observar la muestra al microscopio donde se visualizarán de color violeta las gram positivas y de color rosa-rojizo las gram negativas.

OXIDACIÓN-FERMENTACIÓN MEDIO OF Se utiliza para determinar la fermentación de glucosa, mediante el estudio de dos tubos, uno aerobio y otro anaerobio (con un tampón de parafina)

En un principio los tubos muestra son verdes. Si el tuvo anaerobio se mantiene de este color mientras que el aerobio en su parte superior es amarillo, significa que viró el pH en la zona de contacto con el aire y, por tanto, el metabolismo es oxidativo. En cambio, si toda la muestra cambia de color a amarillo, todo su pH viró y se tratará de una fermentación. Puede darse incluso, que en el tubo aerobio la parte en contacto con el aire oxide. Si no se observa ningún cambio en el color, ni fermentará ni oxidará.

En el caso de las bacterias observadas el resultado es el siguiente:

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Pseudomonas aeruginosa. Oxida la glucosa (aerobiosis) Escherichia coli. Oxida la glucosa en aerobiosis y la fermenta en anaerobiosis (fondo del tubo) Salmonella spp. Oxida la glucosa en aerobiosis y la fermenta en anaerobiosis (fondo del tubo) Klebsiella pneumoniae. Oxida la glucosa en aerobiosis y la fermenta en anaerobiosis (fondo del tubo)

MEDIO ROJO FENOL Es utilizado para la comprobar la oxidación y fermentación de azúcares como la glucosa y la lactosa. El indicador de pH es el rojo fenol, que si varía torna a color amarillo. También analiza si la fermentación genera gas o ácido.

Si el medio se mantiene rojo no hay fermentación. Si torna a amarillo, la fermentación será ácida. Si además de tornar a amarillo, la campana de Durham posee gas, se trata de una fermentación ácida con producción de gas. Por último, si el medio se mantiene rojo y la campana de Durham vuelve a presentar gas, la fermentación será alcohólica. En el caso de nuestras bacterias los resultados obtenidos son:

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Pseudomonas aeruginosa. No fermenta glucosa. Escherichia coli. Fermentación ácida de la lactosa con gas y con glucosa igual. Salmonella spp. Fermentación ácida de glucosa con gas y lactosa sin gas. Klebsiella pneumoniae. Fermentación ácida de lactosa y de lactosa sin gas.

FERMENTACIONES EN CALDO NITRATADO El caldo nitratado es un medio líquido cargado de nitrato, con fuente de carbono y con campana de Durham presente. Es el medio utilizado también para Pseudomonas, con el cual se analiza la respiración anaerobia. Se confirma si se genera gas en la campana. En el estudio de las bacterias obtenemos que:

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Pseudomonas aeruginosa. Fija nitrato. Escherichia coli. No desnitrifica Salmonella spp. No desnitrifica Klebsiella pneumoniae. No desnitrifica

RECUENTO DE BACTERIAS El conteo de bacterias requiere un proceso de diluciones con una posterior siembra con pipeta Pasteur para luego poder contarlas. Su cálculo se obtiene del UFC (unidades formadoras de colonias) x dilución x 10 (100 ml por placa).

STREPTOMYCES Bacteria del suelo no patógena de la cual se obtiene la mayoría de los antibióticos. Se siembra con reveladores, bacterias patógenas para observar de la cual se inhibe su crecimiento (como es el caso de Bacillus), de tal manera que, si Streptomyces inhibe el crecimiento de una bacteria, genera antimicrobianos contra la misma. Por tanto, concretamos que, Streptomyces produce antibióticos contra Bacillus.

ENZIMAS EXTRACELULARES Observamos dos principales enzimas extracelulares: las amilasas, que se producirán en medio de almidón, y proteasas que se cultivan en gelatina. Para detectar su presencia, el almidón se tiñe con Lugol, y las enzimas deberían crear un halo sin teñir alrededor de este, confirmando su presencia. En el caso de la gelatina, esta precipita con ácido clorhídrico, y su no se forma el halo, habrá sido acción de la proteasa que degradó la gelatina.

CONJUGACIÓN BACTERIANA La conjugación bacteriana es el proceso de transferencia de información genética desde una célula donadora a otra receptora, promovido por determinados tipos de plásmidos, y que requiere contactos directos entre ambas, con intervención de estructuras superficiales especializadas y de funciones específicas. El plásmido nunca sale al exterior de la célula, sino que se trasnporta por tubo conjugativo.

ANTIBIOGRAMA Estudio de antibióticos útiles contra un microorganismo. Según la inhibición contra su crecimiento, indica que una bacteria es sensible a cierto antibiótico, como el caso de Streptomyces y Bacillus. El estudio de cómo afecta este antibiótico a una bacteria se llama bioensayo.

YOGURT Producto de leche coagulada obtenido por fermentación láctica mediante la acción de Lactobacillus vulgaris y Streptococcus thermophilus a partir de leche o leche concentrada....