Méthode de purification : chromatographie par exclusion moléculaire ou par filtration sur gel PDF

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Méthode de purification : la chromatographie par absorption...

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Méthode de purification : chromatographie par exclusion moléculaire ou par filtration sur gel 1. Chromatographie par exclusion moléculaire La chromatographie par exclusion ou tamisage moléculaire est une technique qui permet de séparer les molécules en fonction de leur taille et de leur encombrement (forme) Matrice = granules de gel poreux ; le diamètre des pores est contrôlé et fluctue autour d’une valeur moyenne qui est caractéristique de chaque type de gel. Dépôt d’un mélange de molécules : - Molécule de taille > diamètre des pores se déplacent dans la phase extra-granulaire, exclues = 1ères éluées – Ve=V0 volume mort de la colonne - Molécule de taille < diamètre des pores rentrent dans la phase intragranulaire, totalement incluses = dernières éluées – Ve = Vt volume totale de la colonne - Molécule de taille comprise dans les limites du diamètre des pores sont partiellement incluse = éluées dans l’ordre décroissante de la taille La forme d’une colonne de filtration doit être étroite et longue pour une meilleure séparation Pour une bonne séparation, il faut une haute concentration et un faible volume de matériel de départ (1-2% du volume de la colonne pour une résolution max) La filtration sur gel se fait avec un tampon dont la nature ne change pas pendant la séparation. Ceci permet de garder les complexes macromoléculaires. Elle est utilisée pour séparer un mélange de protéine en fin de prification (Superdex G75, G200) Pour chaque colonne d’exclusion moléculaire on peut définir les volumes suivants : - Vt = volume totale - V0 = volume vide (volume de solvant entre les billes, déterminé avec le bleu dextrane) - Vx = Vt – V0 = volume de la matrice (gel+solvant) - Ve = volume d’élution protéine - Vi = Vt – V0 – Vgel = volume du solvant dans les pores de la matrice disponible à la diffusion des petites molécules Coefficient de distribution (kd) ou partage entre la phase mobile et la phase stationnaire est spécifique de chaque molécule et de chaque résine. Kd représente la fraction de la phase stationnaire disponible à la diffusion d’une molécule déterminé. Cependant, pratiquement on définit un coefficient d’avancement Kav qui peut être déterminé facilement Il existe une relation linéaire entre le volume d’élution (et le Kav) et le logarithme de la masse moléculaire La chromatographie par Chromatographie par exclusion moléculaire peut être utilisée pour déterminer la structure oligomérique d’une protéine (composition en sous-unités) : - Masse de la protéine native -> dénaturation -> masse des sous-unités -> Log PM = f(Kav) La dénaturation permet de dissocier les chaines polypeptidiques -> abolition des interactions stabilisant les structures 2re, 3re et 4re. - Disruption des liaison non covalentes (interactions ioniques, ponts hydrogène, interactions hydrophobes) - Disruption des liaison covalentes (ponts disulfures)

Le dodecylsulfate de sodium (SDS) rompt les interaction hydrophobes et ioniques. Le b-mercaptoethanol et le ditiothreitol (DTT) reduisent les ponts disulfures....