Pewarnaan Negatif dan Kapsul PDF

Preview

Summary

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI PEWARNAAN NEGATIF & KAPSUL (Burri-Gins) Rabu, 18 Maret 2015 Kelompok II Rabu, Pukul 10.00 – 13.00 WIB Nama NPM Iman Firmansyah 260110130044 LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN 2015 Nilai TTD Shintya N. A Benedictus G P...

Description

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI PEWARNAAN NEGATIF & KAPSUL (Burri-Gins)

Rabu, 18 Maret 2015 Kelompok II Rabu, Pukul 10.00 – 13.00 WIB

Nama

NPM

Iman Firmansyah

260110130044

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN 2015

Nilai

TTD

Shintya N. A

Benedictus G

PEWARNAAN NEGATIF & KAPSUL

I. Tujuan 1. Mengamati morfologi bakteri yang sukar diwarnai oleh pewarna – pewarna sederhana, dengan menggunakan prosedur pewarnaan negatif. Memahami setiap langkah dan reaksi – reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut. 2. Mengamati kapsul bakteri dengan menggunakan prosedur pewarnaan kapsul (pewarnaan Burri-Gins). Memahami setiap langkah dan reaksi – reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut. II. Prinsip 1. Pewarnaan Negatif Pewarnaan ini tidak akan menembus atau berikatan dengan dinding sel bakteri karena daya tolak menolak antara muatan negatif pewarna dan muatan negatif dinding sel bakteri. Pewarna akan membentuk deposit disekitar bakteri atau menghasilkan latar belakang hitam sehingga bakteri tampak tidak berwarna, sementara latar belakangnya berwarna gelap (Harley, 2002). 2. Tolak Menolak Muatan Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel bakteri, Oleh karena itu dinding sel menjadi tidak berwarna (Hadiutomo, 1990). 3. Kapsul Bakteri Merupakan lapisan lendir yang menyelubungi dinding sel bakteri yang berfungsi untuk perlindungan diri terhadap antibodi yang dihasilkan sel inang (Anshori, 2009).

III. Teori Dasar Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.

Sedangkan pada coccus dibagi menjadi

monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya

dibagi

dua

yaitu

setengah

melengkung

dan

melengkung

(Dwidjoseputro.1998). Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitianpenelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro.1998). Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat (Dwidjoseputro, 1998). Pewarnaan negatif bukan digunakan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam. Pewarnaan negatif atau peawarna asam dapat terjadi karena senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel. Oleh karena itu sel menjadi tidak berwarna. Contoh pewarna yang biasa digunakan yaitu tinta cina, larutan nigrosin, asam pikrat dan eosin. Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada

pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (Hadiutomo, 1990). Klebsiella

pneumonia

adalah

anggota

keluarga

bakteri

Enterobacteraceae yang gram negatif, berbentuk batang, non – motil, bakteri berkapsul dan anaerob fakultatif. Klebsiella pneumonia dapat menyebabkan berbagai infeksi yang biasanya menyerang sistem pernafasan dan saluran kemih seperti pneumonia dan infeksi saluran urine (Agustina, 2014). Kapsul adalah lapisan polimer yang terdapat diluar dinding sel. Kapsul pada bakteri dapat diamati dengan mikroskop dengan teknik pewarnaan, baik secara langsung maupun tidak langsung (Hadiutomo,1990). Contoh bakteri yang berkapsul adalah Klebsiella pneumonia. Bakteri ini diteliti dan diidentifikasi pertama kali oleh bakteriologis Jerman bernama Edwin Klebs. Klebsiella pneumonia terdapat dalam feses dan saluran nafas sebanyak 5% pada orang normal. Klebsiella pneumonia salah satu bakteri gram negative, bakteri yang non motil (tidak melakukan pergerakan secara sel),

merupakan

bakteri

fakultatif

an

aerob,

bakteri

ini

dapat

memfermentasikan laktosa. Klebsiella pneumonia dapat menyebabkan pneumonia (Elfidasari, 2013). Pada sebagian bakteri, terutama yang hidup dilingkungan alami, dikelilingi oleh suatu lapisan lendir (gelatinous) yang disebut kapsul dan slime. Sebagian besar bakteri mensekresikan suatu lapisan berlendir yang mengakumulasi mengelilingi permukaan luar sel dan menyelubungi dinding sel (Fadilah, 2011). Sebagian

ahli berpendapat lapisan lendir merupakan modifikasi

dinding sel terluar yang berasal dari penggembungan dan gelatinisasi konstituennya. Sebagian lagi berpendapat bahwa lapisan lendir adalah produk

sekretori yang mempunyai komposisi kimia berbeda dengan dinding sel. Clifton menyatakan bahwa lapisan lendir ini disusun oleh karbohidrat yang disimpan disekeliling dinding sel. Bila lapisan ini cukup tebal dan mempunyai bentuk yang jelas, disebut dengan kapsul (Fadilah, 2011). Adanya kapsul yang tebal pada berbagai bakteri patogen merupakan indikasi umum tingginya virulensi mikroorganisme. Berbagai penyakit terbukti disebabkan oleh bakteri yang mempunyai kapsul seperti Bacillus antrachis (penyebab antraks), Clostridium pefringens (penyebab gang – rene), dan Streptococcus pneumonia (penyebab pneumonia). Selain itu, adanya kapsul meningkatkan virulensi dan infektifitas bakteri pathogen. Hal ini disebabkan karena kapsul mampu melindungi bakteri pathogen dari fagositosis oleh makrofag dan leukosit polimorfonuklear hewan tingkat tinggi (Fadilah, 2011). Istilah slime diberikan untuk lapisan lendir yang menyelubungi satu koloni bakteri. Slime dibedakan dari kapsul berdasarkan berdasarkan ketebalan dan viskositasnya. Kapsul memiliki struktur yang lebih lebar dan definit serta mudah diamati. Slime bersifat lebih mudah larut dan kurang kental dibanding kapsul. Kapsul adalah bagian dari sel, sedangkan slime adalah hasil sekresi. Kapsul memiliki bentuk yang jelas, baik densitas dan kerangkanya, sementara slime berbentuk amorf dan dapat dilepaskan sehingga menjadi struktur yang bentuknya bermacam – macam, sering terdapat disekitar sel bakteri dan berkurang densitasnya bila jaraknya jauh dari sel. Gladwin dan tarttler menambahkan bahwa kapsul merupakan lapisan lendir yang mengelilingi satu sel tunggal bakteri, sedangkan slime adalaha lapisan lendir yang mengelilingi satu koloni kecil (mikrokoloni) bakteri (Fadilah, 2011). Kapsul membantu sel berkompetisi dalam lingkungan alami dan memudahkan sel melekat ke suatu permukaan substrat. Kapsul merupakan pelindung bakteri yang mencegah terjadinya fagositosis oleh makrofag dan leukosit polimorfonuklear hewan tingkat tinggi. Beishir menambahkan bahwa

fungsi proteksi kapsul ini terjadi melalui peran kapsul sebagai barrier osmotic antara sel dengan lingkungan. Virulensi berbagai bakteri berkapsul berkaitan erat dengan adanya kapsul itu sendiri, Antibodi terhadap kapsul tersebut meningkatkan fagositosis melalui perusakan intra sel secara perlahan. Bila kapsul suatu bakteri hilang, maka sifat virulensinya ikut hilang. Neidhart menambahkan kapsul berperan sebagai determinan utama kemampuan sel bakteri untuk mengkolonisasi niche tertentu (misal : Streptococcus mutans pada gigi) (Fadilah, 2011). Kapsul dan slime umumnya terdiri senyawa polisakarida. Polisakarida ini bervariasi dalam hal komposisi dan kompleksitasnya. Polisakarida yang paling sederhana adalah monopolisakarida

polimer dari monosakarida

termasuk selulosa, levans, dekstrans, dan glukans. Sebagian besar polisakarida ini bersifat kompleks, biasanya memiliki asam uronat sebagai konstituen tambahan. Konstituen monomer dari polisakarida ini mencangkup heksosa netral, khususnya D-glukosa, D-galaktosa, dan D-mannosa; methul pentose seperti L-fukosa & L-ramnosa; polyol seperti ribitol dan gliserol; gula amino dan juga asam uronat. Fosfor juga sering ditemukan, khususnya pada polisakarida yang memiliki polyols asam teikoat. Kapsul dari beberapa jenis Bacillus ( misalnya B. antrachis & B. subtilis ) terdiri dari senyawa polipeptida seperti asam glutamin (Fadilah, 2011).

IV. Alat dan Bahan 1. Alat : a. Bak Pewarna. b. Buku Gambar c. Kaca Objek. d. Kapas. e. Kertas Saring. f. Korek api

g. Mikroskop Majemuk. h. Ose. i. Pembakar Spirtus. j. Pensil warna Merah, Biru, Ungu k. Spidol 2. Bahan : a. Air Suling dalam Botol Semprot. b. Alkohol 70%. c. Desinfektan. d. Emersi Oil. e. Suspensi bakteri Klebsiella sp. f. Zat Warna Air Fuksin. g. Zat Warna Tinta Cina. 3. Gambar alat :

V. Prosedur 1. Pewarnaan Negatif Disediakan dua kaca objek yang sudah di sterilisasi dengan desinfektan dan alkohol 70%. Fiksasi Ose dengan pembakar spirtus.Satu ose suspensi bakteri dan satu tetes tinta cina (1:1) diletakkan di dekat ujung kanan kaca objek pertama. Keduanya dicampurkan menggunakan kaca objek kedua hingga homogen. Kaca objek kedua diletakkan pada kaca objek pertama dengan membentuk sudut 45 o, kaca objek kedua ditarik sepanjang kaca objek pertama dengan diseret ke arah kiri. Preparat dibiarkan hingga mengering dengan sendirinya. Satu tetes minyak emersi diteteskan pada preparat lalu diperiksa di bawah mikroskop. Dimulai dengan lensa objektif berkekuatan terendah 10X, 40 X lalu diganti dengan lensa objektif berkekuatan 100X. Hasil diamati dan digambar.Sel bakteri akan tampak sebagai bagian yang kosong dengan latar belakang yang gelap.

2. Pewarnaan Kapsul Disediakan dua kaca objek yang sudah di sterilisasi dengan desinfektan dan alkohol 70%. Fiksasi Ose dengan pembakar spirtus. Satu ose suspensi bakteri dan satu tetes tinta cina (1:1) diletakkan di dekat ujung kanan kaca objek pertama. Keduanya dicampurkan menggunakan kaca objek kedua hingga homogen. Kaca objek kedua diletakkan pada kaca objek pertama dengan membentuk sudut 45o, kaca objek kedua ditarik sepanjang kaca objek pertama dengan diseret ke arah kiri. Preparat difiksasi sebanyak 3 kali di atas api. Preparat digenangi pewarna air fuksin selama 5 menit, zat berwarna yang berlebih dibuang lalu dikeringkan dengan kertas saring. Satu tetes minyak emersi diteteskan pada preparat lalu diperiksa di bawah mikroskop. Dimulai dengan lensa objektif berkekuatan terendah 40 X. Hasil diamati dan digambar.Sel bakteri akan tampak sebagai bagian yang kosong dengan latar belakang yang gelap.

VI. Data Pengamatan No 1

Perlakuan Pewarnaan negatif.

Hasil Perbesaran 10X

Sampel bakteri Klebsiella sp + Tinta cina + minyak emersi + dilihat dengan mikroskop perbesaran 10X, 40X, 100X

Perbesaran 40 X

Perbesaran 100X

2.

Pewarnaan kapsul. Sampel bakteri Klebsiella sp + Tinta cina + fiksasi diatas pembakar spirtus + Pewarna Air fuksin + minyak emersi + dilihat dengan mikroskop perbesaran 40X.

VI. Pembahasan Pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan bakteri berupa pewarnaan negatif dan pewarnaan kapsul. Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif, pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta cina atau nigrosin, kemudian digesekkan diatas kaca objek .Zat warna tidak akan mewarnai bakteri, akan tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri. Dengan mikroskop mikroba akan terlihat tidak berwarna dengan latar belakang hitam (Lay, 1994). Sedangkan pewarnaan kapsul bisa dilakukan dengan menggunakan nigrosin, merah kongo atau tinta cina. Setelah ditambahkan pewarna yang tidak menembus kapsul, maka kapsul dapat tampak dengan menggunakan mikroskop cahaya. Ini merupakan penampilan negatif kapsul yang terlihat jernih dengan latar belakang gelap (Schlegel, 1994). Sampel bakteri yang digunakan pada praktikum kali ini adalah suspensi bakteri Klebsiella sp. Klebsiella sp salah satu bakteri gram negative, bakteri yang non motil (tidak melakukan pergerakan secara sel), merupakan bakteri fakultatif an aerob, bakteri ini dapat memfermentasikan laktosa (Elfidasari, 2013). Pertama yang dilakukan adalah sterilisasi kaca objek dengan cara memasukan kaca objek kedalam larutan desinfektan dan alkohol 70%. Sterilisasi dalam mikrobiologi berarti membebaskan tiap benda atau substansi dari semua kehidupan dalam bentuk apapun (Curtis, 1999). Setelah melakukan sterilisasi, kemudian melakukan olesan bakteri pada kaca objek, tetapi sebelumnya ose di fiksasi. Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik dengan menggunakan grutaldehid dengan proses pembakaran. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya (Lay, 1994).

Setelah fiksasi selesai kemudian melakukan olesan bakteri pada kaca objek. Lalu tinta cina sebanyak satu tetes, diteteskan di dekat olesan suspensi

bakteri lalu keduanya dicampurkan menggunakan kaca objek kedua hingga homogen. Kaca objek kedua diletakkan pada kaca objek pertama dengan membentuk sudut 45o lalu kaca objek kedua ditarik sepanjang kaca objek pertama dengan diseret ke arah kiri setelah itu preparat dibiarkan hingga mengering dengan sendirinya. Kaca objek tidak perlu difiksasi karena pewarnaan negatif dilakukan untuk melihat bentuk-bentuk sel (Pelczar, 2006). Tinta cina cina bersifat asam dan tidak dapat menembus atau berpenetrasi ke dalam sel bakteri karena tinta cina memiliki muatan negatif dari komponen kromoforik yang akanbertolakan dengan muatan negatif yang dimiliki oleh sitoplasma bakteri sehingga tinta cina hanya akan memberi warna hitam pada latarnya saja (Dwidjoseputro, 1998). Setelah kering tambahkan atau teteskan sedikit minyak emersi. Setetes minyak imersi diteteskan di bawah permukaan kaca objek dan setetes lainnya ke atas lensa depan kondensor. Cara tersebut dilakukan untuk menghindari kemungkinan terbentuknya gelembung udara antara kaca objek dan kondensor. Minyak emersi biasanya dipakai pada pembesaran lensa objektif 100X lebih (Kadaryanto, 2006). Kemudian dilihat dengan mikroskop, dengan perbesaran 10X, 40X, 100X. Hasil pengamatan didapat bakteri Klebsiella pneumoniae yang berwarna bening karena tinta cina yang memiliki muatan negatif dari komponen kromoforik tidak dapat menembus sitoplasma bakteri yang juga bermuatan negatif yang terjadi tolak menolak muatan. Bakteri Klebsiella pneumoniae teramati di perbesaran 10X, 40X, dan 100X. Pada pewarnaan negative ini lingkungan akan terwarnai hitam yang disebabkan oleh pewarna yang digunakan adalah nigrosin atau tinta cina yang memiliki warna dasar hitam. Hal ini juga sesuai dengan pustaka yang

menyebutkan bahwa zat pewarna asam membawa suatu muatan negatif, maka pada sel yang permukaannya juga negatif akan ditolak oleh sitoplasma sel sehingga zat warna ini akan berkaitan dengan lingkungan yang mengelilingi sel dan bagian dalam sel akan tetap berwarna bening (Alcamo,1996). Dalam kondisi pH mendekati netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel bakteri. Oleh karena itu dinding sel menjadi tidak berwarna. Contoh pewarna yang biasa digunakan dalam pewarnaan ini yaitu tinta cina, larutan nigrosin, asam pikrat dan eosin. Selaini itu, disebutkan juga pustaka bahwa bakteri merupakan organisme mikroseluler yang pada dinding selnya mengandung ion negatif, zat warna (nigrosin) yang bermuatan negatif tidak akan mewarnai sel tetapi yang terwarnai adalah lingkungan luarnya saja (Entjang, 2003). Pada pewarnaan kapsul metode Burri-Gins, prosedurnya sama seperti pewarnaan negatif tetapi di tambah dengan pewarna karbol fuksin / air fuksin. Karbol Fuksin merupakan campuaran fuchsin fenol dan dasar yang digunakan dalam prosedur pewarnaan bakteri. Hal ini umumnya digunakan dalam pewarnaan mikrobakteria karena memiliki ketertarikan untuk asam mycolic yang ditemukan di dinding sel mikroba, carbol fuchsin juga digunakan sebagai antiseptik tropikal (Lay,1994). Setelah penambahan pewarna karbol fuksin lalu di tetesi minyak emersi dan di lihat dengan mikroskop dengan perbesaran 40X. Hasil pengamatan didapat bakteri Klebsiella pneumoniae yang berwarna merah yang seharusnya berwarna bening dengan warna merah dibagian tengahnya karena zat warna air fuksin yang bersifa basa (Waluyo, 2007). K. pneumonea adalah organisme batang pendek yang umumnya berbentuk coccoid. Bentuk batang pendek dengan ukuran 0,5 – 1,5 mikron. Mempunyai selubung yang lebarnya 2 sampai 3 kali ukuran kuman. Tidak

berspora, tidak bergerak dan gram negatif. Mudah dibiakkan pada media sederhana Ibouillon agar). Pada media padat tumbuh dengan koloni mucoid (24 jam), putih keabuan dan permukaannya mengkilat. pH untuk hidup 6 – 8,7 dan suhu 35oC. Klebsiella dapat memecah karbohidrat menjadi asam dan gas : laktosa, sukrosa dan inositol (Depkes RI, 1989). Dari hasil praktikum pewarnaan bakteri Klebsiella sp, ciri – ciri bakteri sama dengan yang di cantumkan oleh Depkes RI. VII. Simpulan Dapat mengamati morfologi bakteri yang sukar diwarnai oleh pewarna-pewarna sederhana dengan menggunakan prosedur pewarnaan, dengan hasil bakteri bentuk batang, berwarna bening dengan latar belakang hitam tinta cina. Setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut dapat dipahami. Dapat mengamati kapsul bakteri dengan menggunakan prosedur pewarnaan kapsul (pewarnaan Burri-Gins) dengan hasil bakteri berbentuk batang, sitoplasma sel berwarna merah dan kapsul berwarna bening dengan latar belakang hitam kemerahan. Dapat memahami setiap langkah dan reaksi – reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut.

DAFTAR PUSTAKA

Alcamo, I.E.1996. Fundamental of Microbiology 5th Edition. New York : Addison Wesly Longman. Agustina, Dini. 2014. Inhibition of bacterial adhesion on mice enterocyte by the hemagglutinin pili protein 12,8 kDa klebsiella pneumoniae antibody. The Journal of Tropical Life Science, Vol.4, No.1, pp. 19 – 25. Anshori, M. 2009. Panduan Pembelajaran Biologi untuk SMA dan MA Kelas XI. Jakarta : Pusat Perbukuan Departemen Pendidikan Nasional. Curtis. 1999. Biology 5th edition. New York : Worth Publisher Departemen Kesehatan RI. 1989. Bakteriologi Klinik. Jakarta : Bakti Husada. Dwidjoseputro, D.1998.Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan. Elfidasari, Dewi. 2013. Deteksi bakteri Klebsiella pneumonia pada beberapa jenis rokok konsumsi masyarakat. Jurnal Al-Azhar Indonesia Seri Sains dan Teknologi, Vol.2, No.1, pp.41 – 47.

Entjang, I. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi Untuk Akademi Keperawatan. Bandung: Citra Aditya Bakti. Fadilah, Muhyiatul.2011. Deteksi kapsul dan slime pada bakteri patogen yang diisolasi dari benih lele dumbo. Jurnal Sainstek Vol.III, No.2, pp.124 – 128.

Hadiutomo. 1990.Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga. Harley. 2002. Laboratory Exercise in Microbiology. USA: Mc Graw – Hill Publisher. Kadaryanto. 2006. Biologi 1 Mengungkap Rahasia Alam Kehidupan. Jakarta : Yudhistira. Lay, Bibiana.W.1994. Analisis Mikroba di Laboratorium .Jakarta : Rajawali. Pelezar,chan. 2006. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press.

Schlegel, Hans. 1994. Mikrobiologi Umum Edisi Keenam. Yogyak...