Pewarnaan Tahan Asam PDF

Preview

Summary

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI PEWARNAAN TAHAN ASAM Rabu, 11 Maret 2015 Kelompok II Rabu, Pukul 10.00 – 13.00 WIB Nama NPM Iman Firmansyah 260110130044 LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN 2015 Nilai TTD PEWARNAAN TAHAN ASAM I . Tujuan Mengamati dua kelo...

Description

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI PEWARNAAN TAHAN ASAM

Rabu, 11 Maret 2015 Kelompok II Rabu, Pukul 10.00 – 13.00 WIB

Nama

NPM

Iman Firmansyah

260110130044

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN 2015

Nilai

TTD

PEWARNAAN TAHAN ASAM

I . Tujuan Mengamati dua kelompok bakteri tahan asam dan bakteri tak tahan asam, dengan menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam pewarnaan (Ziehl-Neelsen). Memahami setiap langkah dan reaksi – reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut. II. Prinsip 1. Penetrasi zat warna Difusi zat warna dari lapisan permukaan ke pusat. Agar penetrasi zatzat warna baik dan tahan cuci, maka gaya ikat antara zat warna dan sampel harus lebih besar dari pada gaya – gaya yang bekerja antara zat warna dan air (Etsha, 2013). 2. Pewarnaan tahan asam Tipe pewarnaan diferensial lebih dari satu pewarna untuk membedakan suatu mikroorganisme dengan kandungan dinding sel peptidoglikan serta disusun lebih dari 60% lipid kompleks yang tahan terhadap dekolorisasi dengan alkohol asam (Temaja, 2010). 3. Pemanasan Melebarkan pori – pori lemak bakteri tahan asam sehingga zat warna dapat masuk sewaktu bakteri asam dicuci dengan larutan pemucat, yaitu asam alkohol, maka zat warna pertama tidak mudah di lunturkan (Lay, 1994). 4. Impermeabilitas dinding sel bakteri tahan asam Bakteri tahan asam memiliki kandungan senyawa dari peptidoglikan dan lipid kompleks (wax-D) yang disebut asam mycolat yang membangun struktur dinding selnya, sehingga menjadi impermeabel terhadap macam – macam prosedur perwarnaan termasuk pewarnaan Gram (Lay, 1994).

III. Teori Dasar Bakteri tahan asam adalah jenis bakteri yang tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan anilin biasa kecuali dengan menggunakan fenol dan dengan pemanasan. Bakteri ini memilki dinding sel berlilin karena mengandung sejumlah besar materi lipoidal oleh karena itu bakteri ini hanya dapat diwarnai dengan pewarnaan BTA (Acid-Fast Stain). Dinding sel hidrofobik dan impermeabel terhadap pewarnaan dan bahan kimia lain pada cairan atau larutan encer. Ketika proses pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan asam sehingga bakteri tersebut disebut bakteri tahan asam (Ball, 1997). Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat tebal sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus dengan pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA) karena dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen pada manusia contohnya adalah Mycobacterium tuberculosis. Bakteri Mycobacterium tuberculosis dapat diisolasi dari sputum penderita TBC. Reaksi hasil pewarnaannya jika positif terdapat bakteri TBC berwarna merah. Selain menyerang manusia juga menyerang hewan seperti marmut, dan kera. Penularannya dapat melalui udara yang masuk ke saluran pernafasan (Pelczar, 1988). Contoh dari bakteri tahan asam yaitu dari genus Mycobacterium. Bakteri ini memiliki sejumlah besar zat lipoidal (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relative tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel-sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau pewarnaan gram (Dwidjoseputro, 1994). Mycobacterium tuberculosis termasuk gram positif, berbentuk batang panjang atau pendek, tidak berspora, tidak berkapsul, pertumbuhan sangat

lambat (2-8 minggu), suhu optimal 37-380C yang merupakan suhu normal manusia. Pertumbuhannya membutuhkan tambahan makanan seperti darah, egg yolk, serum, dan bahan kimia tertentu. Dalam jaringan, basil tuberkel adalah bakteri batang lurus dengan ukuran sekitar 0,4 – 3 μm. Pada media buatan, bentuk kokoid dan filamentous tampak bervariasi dari satu spesies ke spesies lain. Segera setelah diwarnai dengan pencelupan dasar mereka tidak dapat didekolorisasi oleh alkohol, tanpa memperhatikan pengobatan dengan iodine. Basil tuberkel secara umum dapat diwarnai dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen. Media untuk membiakan mikobakteria adalah media nonselektif dan media selektif. Media selektif berisi antibiotik untuk mencegah pertumbuhan kontaminan bakteri dan fungi yang berlebihan. Ada tiga formulasi umum yang dapat digunakan untuk kedua media nonselektif dan selektif, yaitu media agar semisintetik (middlebrook 7H10 dan 7H11), media telur inspisasi (Lowenstein-jensen), media kaldu (broth media) (Jawetz, 2001). Mycobacteriu merupakan aerobik obligat yang memperoleh energi dari oksidasi beberapa senyawa sederhana. Penambahan CO2 meningkatkan pertumbuhan. Tidak ada aktivitas biokimia yang menandai. Dan kecepatan pertumbuhan lebih rendah dari pada sebagian besar bakteri. Waktu untuk menggandakan basil tuberkel sekitar 18 jam, bentuk saprofit cenderung tumbuh lebih cepat, poliferasi terjadi pada temperatur 22-23˚C, untuk menghasilkan pigmen yang lebih banyak dan mengurangi bentuk ”cepat asam” daripada bentuk patogenik. Mikobakteria cenderung lebih resisten terhadap agen kimia daripada bakteri lain karena sifat hidrofobik permukaan sel dan pertumbuhannya. Basil tuberkel reisten terhadap kekeringan dan bertahan hidup selama periode waktu yang lama dalam sputum kering. Variasi dapat terjadi dalam koloni, pigmentasi, virulensi, temperatur petumbuhan yang optimal dan beberapa tanda pertumbuhan atau seluler lainnya (Fardiaz, 1992).

Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat warna carbol fuchsin 0,3 %, asam alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%. Pada pemberian warna pertama, yaitu carbol fuchsin, BTA bersifat mempertahankannya. Carbol fuchsinmerupakan fuksin basa yang dilarutkan dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan warna merah pada sediaan dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu pemasukan zat warna ke dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan. Fungsi pemanasan untuk melebarkan pori-pori lemak BTA sehingga carbol fuchsin dapat masuk sewaktu BTA dicuci dengan larutan pemucat, yaitu asam alkohol, maka zat warna pertama tidak mudah dilunturkan. Bakteri kemudian dicuci dengan air mengalir untuk menutup pori-pori dan menghentikan pemucatan. BTA akan terlihat berwarna merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan melarutkan carbol fuchsin dengan cepat sehingga sel bakteri tidak berwarna. Setelah penambahan zat warna kedua yaitu methylen blue, bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru (Lay, 1994). Pada pewarnaan

bakteri

dengan

metode

Ziehl-

Neelsendapat menggolongkan bakteri menjadi dua, yaitu : 1.

Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri tahan asam (acid fast).

2.

Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri tidak tahan asam (non acid fast) (Entjang, 2003).

IV. Alat dan Bahan 1. Alat : a. Bak Pewarna. b. Buku Gambar c. Cawan Petri d. Kaca Objek. e. Kapas. f. Kertas Saring.

g. Korek api h. Mikroskop Majemuk. i. Ose. j. Pembakar Spirtus. k. Pensil warna Merah, Biru, Ungu l. Spidol m. Tabung Reaksi n. Water Bath 2. Bahan : a. Air Suling dalam Botol Semprot. b. Alkohol 70%. c. Asam Alkohol (3% HCL dalam alkohol 95%) d. Desinfektan. e. Emersi Oil. f. Sampel Air Liur. g. Suspensi Bakteri saprofit h. Zat Warna Karbol Fuksin. i. Zat Warna Metilen Biru. 3. Gambar Alat

V. Prosedur Sampel suspensi bakteri di siapkan di dalam tabung reaksi. Kaca objek di sterilisasi dengan cara dicuci, lalu dimasukkan kedalam larutan desinfektan, kemudian dimasukkan kedalam larutan alkohol 70%. Setelah kaca objek disterilisasi, di lap menggunakan kapas sampai mengeluarkan suara berdecit. Lingkari bagian bawah kaca objek dengan spidol sebagai area untuk pengolesan sampel bakteri. Ose difiksasi dengan cara dibakar dengan

pembakar spirtus sampai ose berpijar. Ose di dinginkan dengan cara didekatkan dengan pembakar spirtus. Di buat olesan dari suspensi bakteri, digenangi olesan bakteri dengan pewarna karbol fuksin selama 5 menit, sambil di panaskan diatas penangas air. Di jaga jangan sampai terlalu panas, mendidih atau kering. Di buang zat warna yang berlebih, lalu di bilas dengan aquades. Dibilas dengan zat pemucat asam alkohol selama 15 detik atau sampai latar belakang olesan berwarna merah muda pucat. Kemudian olesan digenangi dengan pewarna tandingan metilen biru selama 2 menit, dibuang zat warna yang berlebih, lalu bilas dengan aquades, dikeringkan dengan kertas saring. Diteteskan sedikit minyak imersi pada preparat / objek gelas, lalu diperiksa di bawah mikroskop. Di amati dan di gambarkan hasilnya.

VI. Data Pengamatan No

Perlakuan Olesan bakteri + Karbol fuksin + Di panaskan di penangas air + Dibilas aquades + Asam alkohol + Metilen biru + Dibilas

1

aquades + Dikeringkan dengan kertas saring + Ditetesi Minyak imersi + Dilihat dengan mikroskop dengan pembesaran 100X

Hasil

VII. Pembahasan Pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan bakteri berupa pewarnaan tahan asam. Bakteri tahan asam adalah jenis bakteri yang tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa kecuali dengan menggunakan asam alkohol dan dengan pemanasan. Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat tebal, sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus dengan pewarnaan tahan asam. Bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Ketika proses pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan asam sehingga bakteri tersebut disebut bakteri tahan asam. Pertama yang dilakukan adalah sterilisasi kaca objek dengan cara di celupkan kedalam larutan desinfektan kemudian dicelupkan kedalam alkohol 70%. Sterilisasi bertujuan untuk memusnahkan atau mengeliminasi semua mikroorganisme termasuk spora bakteri yang resisten dalam alat yang akan digunakan. Setelah melakukan sterilisasi, kemudian melakukan olesan bakteri pada kaca objek, tetapi sebelumnya ose di fiksasi di api pada pembakar spiritus yang bertujuan untuk mematikan bakteri dengan cepat pada ose, supaya tidak tercampur dengan bakteri yang akan di uji. Sebelum melakukan pengolesan bakteri, kaca objek di beri tanda lingkaran di bawahnya sebagai tanda area untuk melakukan pengolesan sel bakteri dari suspensi. Pada percobaan kali ini pengolesan di lakukan dengan sampel suspensi bakteri saprofit (Mycobacterium tuberculosis). Kemudian olesan di teteskan pewarna karbol fuksin. Karbol fuchsin merupakan pewarna dasar, yang mengandung fenol untuk membantu melarutkan dinding sel. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu pemasukan zat warna kedalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan. Tujuan

memberikan pewarna karbol fuksin adalah untuk mewarnai seluruh sel bakteri. Setelah memberikan pewarna karbol fuksin kemudian di panaskan di atas penangas air, tetapi jangan sampai terlalu panas, mendidih atau kering. Tujuan dari memanaskan sampel di atas penangas air yaitu supaya pewarna karbol fuksin masuk menembus dinding sel bakteri, karena dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang sukar di tembus pewarna bakteri. Karena pengaruh fenol dari pewarna karbol fuksin dan juga pemanasan maka lapisan lilin dan lemak dapat ditembus pewarna karbol fuksin. Dengan pemanasan menyebabkan pelebaran pori – pori lemak bakteri tahan asam sehingga pewarna karbol fuksin dapat masuk sewaktu dicuci dengan larutan pemucat, dan zat warna pertama tidak mudah dilunturkan. Setelah 5 menit dibilas dengan aquades. Pencucian dengan menggunakan aquades mengalir bertujuan untuk menutup kembali lemaknya. Kemudian sampel di tetesi asam alkohol selama 15 detik. Asam alkohol berfungsi sebagai peluntur. Pada saat pencucian, lapisan lilin dan lemak yang tadinya terbuka akan menutup kembali. Bakteri tahan asam pada saat dicuci dengan asam alkohol warna karbol fuksin tidak lepas atau hilang, sedangkan pada bakteri tidak tahan asam akan lepas atau hilang. Setelah itu sampel di tetesi atau di genangi pewarna tandingan metilen biru. Metilen biru adalah pewarna yang biasa di pakai dalam pewarnaan umum. Biasanya hanya untuk membedakan sel bakteri dengan latar belakangnya. Setelah 2 menit sampel dibilas dengan aquades lalu di keringkan dengan kertas saring. Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap kaca objek dengan menggunakan aquades. Pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan.

Objek yang telah dibasuh aquades kemudian dikeringkan dengan menggunakan kertas saring, tidak ditiup-tiup karena dikhawatirkan ada kontaminasi bakteri lain yang menempel pada objek glass. Sampel yang sudah di keringkan, di tetesi dengan emersi oil. Minyak emersi adalah minyak yang di pakai untuk olesan pada mikroskop, yang fungsinya untuk memperjelas objek, dan melindungi mikroskop. Minyak emersi memiliki indeks refraksi yang tinggi dibandingkan dengan air, sehingga objek yang kita amati dapat terlihat lebih jelas dibandingkan dengan tanpa minyak emersi. Lalu diamati dengan mikroskop, dengan pembesaran 100X. Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang langsing, lurus atau berbentuk filament. Sekali mycobacteria diberi warna oleh pewarnaan gram, maka warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan asam. Ketika proses pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan asam. Oleh karena itu, maka mycobacteria disebut sebagai bakteri tahan asam. Bakteri ini memiliki sejumlah besar zat lipoidal (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relative tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel-sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana.

VIII. Simpulan Dapat mengamati dua kelompok bakteri tahan asam dan bakteri tak tahan asam, dengan menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam pewarnaan (Ziehl-Neelsen) dengan hasil bakteri berupa than asam yaitu bakteri Mycobacterium tuberculosis .

Dapat memahami setiap langkah dan reaksi – reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut dengan hasil bakteri berwarna merah yang berarti bakteri melawan dekolorisasi dengan asam.

DAFTAR PUSTAKA

Ball, A.S. 1997. Bacterial Cell Culture : Essential Data. New York : John Wiley & Sons. Dwidjoseputro. 1989. Dasar-dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan. Entjang, I. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi untuk Akademi Keperawatan dan Sekolah Tenaga Kesehatan Yang Sederajat.Bandung : Citra Aditya Bakti. Etsha. 2013. Makalah Celup. Tersedia di http://www.slideshare.net/Etsha/ makalah-celup-iii [Diakses pada 15 Maret 2015]. Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan. Jakarta : P.T Gramedia Pustaka Utama. Jawetz, Melnick, Adelberg’s. 2001. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta : Salemba Medika. Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : PT Raja Grafindo Persada. Pelczar, M. J. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid 2. Jakarta : UI – Press. Temaja, D.B. 2010. Pewarnaan Sel Bakteri. Tersedia di http://www.scribd.com/ doc/31810329/PEWARNAAN-BAKTERI [Diakses pada 15 Maret 2015]....