Práctica No.5 Inmunodifusión radial simple (RID) PDF

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Práctica de laboratorio de inmunología general, estudio de técnicas de detección, inmunodifusión radial simple (RID)....

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Universidad Autónoma de Tamaulipas. Unidad Académica Multidisciplinaria Reynosa-Aztlan Titulares: Dr. Flores Martínez Luis Javier / M. en C. De León De la Torre Adrian.

« Inmunodifusión radial simple (RID)»

OBJETIVOS. Trazar la curva de calibración con los estándares de albúmina sérica humana (ASH). Determinar la cantidad de ASH en las muestras problema obtenidas de distintos pacientes.

2 (MP2) y Problema 3 (MP3). Las tres muestras problemas tienen dilución 1:10 Debido a que se realizó por duplicado la prueba, se presentarán los dos resultados. Tabla 1. Resultados de las mediciones realizadas sobre la placa RID

Comparar las cantidades obtenidos con los valores de referencia para albúmina en suero en personas sanas. RESULTADOS. Se realizaron adiciones de 5μL de cada una de las soluciones en las horadaciones realizadas en la placa RID. Se siguió la adición como se muestra en la Figura 1. Se dejó incubar 48 horas a temperatura ambiente. Se realizaron las mediciones del diámetro con una regleta para RID. Las muestras fueron diluidas 1:10 para poder ser cuantificadas por este método.

Muestra Estándar 1 Estándar 2 Estándar 3 MP 1 MP 2 MP 3 Estándar 1 Estándar 2 Estándar 3 MP 1 MP 2 MP 3

Diámetro2 (mm2) 73.95 121 169 88.35 53.3 0 62.4 121 169 77.45 51.85 37.2

Concentración (g/dL) 0.2 0.5 0.8 2.92 0.71 0* 0.2 0.5 0.8 2.75 1.31 0.482

Ejemplo de cálculo de la concentración de las muestras problemas. Obteniendo la ecuación de la curva de calibración calculamos las concentraciones para cada muestra problema (muestra problema uno). Figura 1. Diagrama de la placa de RID elaborada. Estándar 1 (E1):0.2g/dL, Estándar 2 (E2): 0.5g/dL, Estándar 3 (E3):0.8g/dL, Problema 1 (MP1), Problema

𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏

Donde

1

180 160

Diámetro2 (mm2)

140 120 100

y = 158.42x + 42.108 R² = 1

80 60 40 0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

Figura 2. Curva de calibración 1. Correspondiente a los valores obtenidos para los pozos uno, dos y tres.

Concentración (g/dL)

190 170

Figura 3. Curva de calibración 2. Correspondiente a los valores obtenidos para los pozos siete, ocho y nueve.

Diámetro2 (mm2)

150 130 110 y = 177.67x + 28.633 R² = 0.9967

90 70 50 30 0

0.1

0.2

(g/dL) 0.6 0.3 Concentración 0.4 0.5

0.7

0.8

0.9

2

ANÁLISIS DE RESULTADOS.

y = Diámetro2 [mm2] m = Concentración [g/dL] b = Ordenada al origen [mm2] x = Muestra problema

88.35 𝑚𝑚2 = 158.42 (

𝑑𝐿 𝑔 ) 𝑚𝑚2 (𝑥 ) + 42.108 𝑚𝑚2 𝑑𝐿 𝑔

Despejando obtenemos que:

𝑥=

88.5 𝑚𝑚2

− 42.108 𝑚𝑚2

158.42 (

𝑥 = (0.292

𝑑𝐿 ) 𝑚𝑚2 𝑔

𝑔

) (10) = 2.92 𝑔⁄ 𝑑𝐿 𝑑𝐿

El valor 10 corresponde al factor de dilución utilizado, es decir, la proporción a la que el suero humano fue diluido. Tabla 2. Resultado de la cuantificación de la albúmina de suero humana.

1 1´ 2 2´ 3

Concentración (g/dL) 2.92 2.75 0.71 1.31 0

3´

0.43

Muestra

Promedio (g/dL) 2.84 1.01 0.43*

*No se consideró el promedio de la muestra 3, porque el ensayo #1 no se observó difusión.

La Inmunodifusión radial simple (RID) es un procedimiento que permite cuantificar de manera sencilla, precisa y exacta la concentración de proteínas especificas en líquidos biológicos (Mancinni et al, 1965). La proteína a cuantificar (albúmina), se colocó sobre una placa de agar noble, al cual previamente se le adicionó el anticuerpo específico (anti ASH), de manera que a través de una RID formó un inmunocomplejo visible (precipitado), siendo en este caso un anillo alrededor del pocillo de siembra. El diámetro de este anillo es proporcional a la concentración de la proteína analizada por lo que podemos obtener las concentraciones mediante una curva de calibración elaborada con concentraciones de albúmina conocida. Los valores de concentración variaron a pesar de que pertenecían a la misma muestra, esto probablemente se deba a que la cantidad de muestra que se vertió en cada pozo no fue la misma debido a errores de pipeteo de cada analista, no obstante este error se ve reducido cuando una persona carga tanto muestras como estándares de concentración como nosotros realizamos. Por otro lado, las horadaciones juegan un papel muy importante ya que de estas dependerá la difusión radial, por lo que si se encontraban deformadas o en su defecto lastimado el agar; la difusión no sería uniforme y a la misma velocidad. En el caso de la muestra problema uno no hubo tanta diferencia en el resultado, estos fueron muy similares entre sí, obteniendo una concentración de 2.84 g/dL. En la segunda muestra problema, hubo una diferencia de 0.4 g/dL obteniendo un promedio de ambas de 1.01 g/dL, mientras que en la muestra problema tres en el primer pozo no hubo difusión lo cual indica que la adición de muestra se realizó de manera incorrecta o que la muestra no contenía ASH (posiblemente la toma de muestra no se homogenizó correctamente), sin embargo, al realizarse por duplicado, se observa la presencia de la proteína antes mencionada en la muestra tres con una concentración de 0.43 g/dL. La albúmina es una proteína sintetizada en el hígado y cuya concentración en suero (también puede ser detectada en exámenes de orina) puede ser indicador de distintas enfermedades. El rango normal de concentración de albúmina en sangre está entre los 3.4 y 5.4 g/dL. Las concentraciones que superan ese rango pueden ser causadas por deshidratación o por una dieta rica en proteínas. Las concentraciones por debajo del rango normal pueden deberse a problemas renales o

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hepáticos e incluso por quemaduras (Martin, 2015). En esta ocasión, las concentraciones de las 3 muestras problema se encuentran por debajo del rango normal de albúmina en suero, lo que nos indica que es posible que los pacientes de los que se obtuvo el suero presenten algún problema hepático o renal; el cual disminuye la concentración de albúmina en plasma.

CONCLUSIONES. La curva de calibración uno posee un r2 = 1, tal número indica una buena aproximación de los valores para reportar la concentración de albúmina, al igual que la curva de calibración dos con un r2 = 0.99. La concentración de albúmina obtenida tanto de la muestra 1, 2 y 3 es de 2.84, 1.01 y 0.43 g/dL, respectivamente, tales concentraciones se encuentran por debajo del valor de referencia reportado en personas sanas que es de 3.4 a 5.4 g/dL.

BIBLIOGRAFÍA. 1. Martin, J. Albúmina: examen de sangre (suero), MedlinePlus, Biblioteca Nacional de Medicina de los EE.UU.; última actualización en 2015. Disponible en: https://medlineplus.gov/spanish/ency/article /003480.htm

2. Mancini, G., Carbonara, A. O., Heremans J. F. Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion. Immunochem, 1965 (2); pp. 235-254.

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