Preparación Células Competentes PDF

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Protocolo y guia de tips para la preparacion de celulas competentes...

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Preparación Células Competentes

Objetivos  Repasar principios básicos y protocolo de preparación de bacterias competentes.  Preparar bacterias competentes.  Realizar protocolo de transformación.

Pasos a seguir para la clonación  Aislamiento  Amplificación (PCR)  Digestión ER : Plásmido y DNA a clonar  Ligación ( in vitro, ligasa)  Transformación (bacterias competentes)  Selección  “Screening”

Células competentes  capaces de permitir la entrada de DNA a través de su membrana  La pureza de los reactivos usados en los buffers de transformación  La etapa de crecimiento de las células  Bacterias crecidas del “stock” original y almacenadas a -70 C

 Lag à Log à Plateau  La limpieza del equipo usado  Presencia de detergentes Métodos para obtener células competentes  Electroporación (electrotransformación)  Mas fácil, mas eficiente  Aplicación de un elevado voltaje a células durante un periodo de tiempo muy corto.

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 Las membranas se despolarizan sus membranas y se forman pequeños orificios por los que penetran las moléculas (proteínas, DNA,...) que se encuentran alrededor.  Ventaja: se aplica a millones de células a la vez; se obtienen eficiencias de entrada de las moléculas del 100% de las células que sobreviven (centenares de miles a millones).

 Transformación química  CaCl2

Protocolo 1. Empezamos con E. coli en caldo de LB 2. Centrifugar 4000 rpm por 10 minutos 3. Decantar el medio, invertir el tubo por 1 minuto 4. Resuspender el “pellet” en 1 ml de 0.1 M CaCl2 (en hielo) (Cl-/ Ca+2 / Hielo) 5. Centrifugar por 10 minutos 6. Decantar 7. Repetir el paso 4

8. Transferir 1.0 mL de las bacterias competentes a un tubo de ensayo. 9. Añadir la reacción de ligación. 10. Transferir los tubos a un baño de maría a 42°C por 90 segundos “Heat shock” 11. Regresar los tubos al hielo por 2 minutos. 12. Añadir 175 uL de LB, mezclar usando el “Vortex” 13. Transferir la mezcla de las células competentes + el DNA recombinante al LB soft agar, mezclar. 14. Colocar el LB soft agar sobre una placa de LB agar y mezclar hasta que cubra la placa completa (doble capa) 15. Esperar hasta que se endurezca, invertir la placa e incubarla a 37°C por 8-12 horas....