Préparation des Echantillons PDF

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Description

Préparation des échantillons Source de rayonnement

Microscope

Photons

Photonique ou optique (MP ou MO)

Observation

Préparation -

Interne par transparence

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Electronique à Transmission (MET) traverse l’échantillon

Interne par transparence

Electrons Electronique à Balayage (MEB) Rebondisse sur l’échantillon

De surface

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Finesse, coupes de 0,5µm Contraste par des colorants aqueux Finesse, coupes de 0,1µm Contraste par des sels de métaux lourds

Traitement Spécifique : - Contraste par métallisation des surfaces

Le pouvoir séparateur ou résolution est la plus petite distance entre deux éléments sur un échantillon pour qu’ils soient visibles distinctement l’un de l’autre. MP : 0,5micro mètre ME : 1 nm Grandissement max : MP: x 1000 MET-MEB : x 500 000

I – Réalisation de coupes histologiques A – Préparation de coupes histologiques pour le microscope photonique à fond clair ▪ La fixation : Permet de figer les tissus dans un état le plus proche possible de celui du vivant et éviter la dégradation dans le temps. (Fixateurs chimiques ou coagulants qui détruisent les ultrastructures ; le plus fréquemment utilisé est le carnoy (résultat d’un mélange de 6 volumes d’alcool 100, de 3 volumes de chloroforme et d’un volume d’acide acétique)) -

Bain de 1 à 2 heures : En morceau, le temps dépend de la nature de l’organe à fixer, (ex intestin = creux donc besoin de moins de temps que le foie qui est un organe plein et très vascularisé. Le premier bain permet d’éliminer le sang. Rinçage à l’alcool 100 par 3 bain de 30 min : Arrêt de la fixation et déshydratation complète de l’échantillon.

▪ L’inclusion : est une étape qui permet de solidifier l’échantillon dans le but de réaliser des coupes. En MO, l’inclusion se fait en paraffine. La paraffine est un composé hydrophobe, non miscible à l’alcool 100 et liquide à 56°C, c’est pourquoi il faudra travailler à une température supérieure à 56°C. L’inclusion nécessite plusieurs étapes préalables : -

Bain intermédiaire au butanol pendant 1 heure à température ambiante (Paraffine et alcool ne se mélange pas) 2 ème bain au butanol à 60°C (éviter les choc thermique). On le fait chauffer dans une étuve en faisant attention qu’il n’ai pas d’échappement de vapeur pour éviter l’inflammation et à l’accumulation dans étuve pour éviter l’explosion. Pré-inclusion : bain de 1 heure dans un mélange butanol/paraffine (50-50) à 60°C. Puis par deux bains de 1 heure dans de la paraffine liquide pure à 60°C. Inclusion : Réaliser de petit bloc de paraffine dans des barres de leuckart.

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On va couler de la paraffine et venir ajouter rapidement l’échantillon pour éviter le détachement de l’échantillon du bloc. L’échantillon a était pris avec une pince fine, préchauffé. L’échantillon doit être au milieu du bloc de paraffine et être possible de le repéré . ( astuce donné en TP) il faut identifier les block avec le nom du fixateur et l’organe . Démoulage à froid

▪ Préparation : -

Tailler le bloc : pour limiter la quantité de paraffine autour de l’échantillon avec un scalpel métallique en repérant l’échantillon . Tailler une pyramide et taillant les 4 faces mais pas la base du bloc.

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Réalisation de la coupe avec le microtome. o

Echantillon est fixé sur un support solide qui réside à la chaleur : on chauffe la plaque et la dépose sur la paraffine. A l’aide d’un scalpel chauffé on fait fondre les 4 face du bloc pour fixer parfaitement l’échantillon.

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L’échantillon et son support son placé dans le mord du microtome. On coupe a l’aide d’une lame de rasoir à 5 micromètre d’épaisseur en courant la manivelle dans le sens des aiguilles d’une montre( 1 tour de manivelle = 5micromètre). L’échantillon va glisser sur la plaque métallique puis récupéré avec une pince. On tourne sans interaction pour obtenir un ruban de coupe .

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Le ruban est déposé sur une plaque en verre : pour le coller on met de l’eau albumineuse ( eau avec du blanc d’oeuf) sur la plaque et sera en contact avec la face fondu de la coupe (donc ne pas tourner le ruban), on dépose dans le sens de coupe .

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Chauffe l’ensemble pour l’adhérence sur les lames.

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A coté du microtomes se trouve une platine chauffante avec une plaque noir où on dépose l’échantillon. On ajoute de l’eau albumineuse et de l’eau distillée. Il faut tourner et tirer en même temps pour détendre la coupe et ramollir la paraffine (t° de la platine chauffante = 30°C qui ramolli sans faire fondre la paraffine). On y reste 30-40 secondes le temps se détermine à l’oeil. Il ne faut pas rester trop longtemps sinon l’échantillon va cuire. Une fois la paraffine grisâtre et transparente il faut arrêté.

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Pour enlever le reste d’eau non éliminer on bascule la lame au dessus de papier absorbant en retenant avec une pince l’échantillon, on dépose ensuite la lame sur le papier absorbant et avec un mouchoir on appuie pour absorbé le reste d’eau .

Si on a assez fondu l’échantillon le coupe va resté sur la lame sinon elle restera sur le papier absorbant. Si c’est bruler on ne le verra qua l’observation de l’échantillon . o

On parfait le séchage de la coupe 24h à 37°C.

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▪ Le contraste : permet de visualiser les structures et de les mettre en évidence. On utilise des colorant aqueux (= poudre que l’on dilue dans de l’eau). ▪

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2 types de colorations : -

Coloration en 1 temps : 1 colorant ou plusieurs colorant mélangé. On plonge l’échantillon 1 seule fois puis on rince.

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Coloration successive : Plusieurs colorant que l’on va plonger successivement en rinçant avec de l’eau distillé entre chaque. (ex : erythrosine, bleu de toluidine: on respect l’ordre donné dans le nom de la coloration)

2 catégories de colorations : -

Colorations Anatomiques

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Coloration histochimie : On fait réagir le colorant ou les colorants qui vont réagir avec des éléments présent dans la cellule. Permet de relever la présence de composé. (Est toujours associée à de l’anatomique)

Pour que les colorant aqueux agissent il faut que le l’échantillon soit aussi avec de l’eau ( = hydraté) . -

Déparaffinage : retirer la paraffine (n’entraine pas de modification des éléments de l’échantillon) grâce à l’histolemon (=HTL, solvant de la paraffine). On trempe l’échantillon 2 min dans un bain d’HTL avec des mouvements du bas vers le haut. On répète une deuxième fois cette étape.

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Réhydraté l'échantillon . Etape d’hydratation par une gamme d’alcools aux degrés décroissant : 2min alcool 100 → 2 min alcool 95 → 2min Alcool 70 → puis dans de l’eau.

Ensuite on réalise la coloration successive .

Pour pouvoir observé les échantillon on doit faire un montage : Echantillon + Baume du canada (fixe) + Lamelle (protège les coupes)

Le baume du canada a des propriétés spécifiques: -

Hydrophobe : Il faut déshydraté l’échantillon avec l’alcool 100

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N’est pas miscible à l’alcool 100 : trouvé un intermédiaire = l’histolémon

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Avantage indice de réfraction proche du verre = image correct le l’échantillon

On utilise alors un deuxième rack avec la déshydrations puis l’histolémon (voir image). Pour remonter (déshydraté) une minute suffit. Dans le dernier bécher, il faut laisser la lame dans l’histolémon . On met le baume sur la lamelle puis on prend vite l’échantillon pour venir les coller ensemble. Il faut mettre à l’étuve au moins 24H (on ne fera pas on regardera directement attention donc quand on passe l’objectif 60 que ça ne glisse pas et que ça s’étale pas sur l’objectif ) Nb: il vaut mieux faire de petit ruban que un grand ruban car la lamelle est petite et si c’est en dehors ce n’est pas visible.

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B – Préparation de coupes pour le microscope électronique à transmission -

Fixation : Fixateur non coagulant (tétroxyde d’osmium ou glutaraldéhyde). Pas le carnoy car il modifie l’ultrastrucutre : pas dérangement car on le voit pas l’ultra structure en MP.

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Déshydratation : Avec de l’alcool 100 pour parfaire la déshydratation

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Inclusion : A la résine qui va fortement durcir l’échantillon, on va faire de tout petit bloc.

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Coupe < 0,1 um à l’ultra-microtome avec un couteau de verre ou de diamant. On met de l’eau distillé dans le couteau de diamant, on le récupère les découpes avec une grille que l’on frôle la surface de l’eau (= effet électrostatique) ou en plongeant la grille.

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On met à séché la grille

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Coloration : Avec des métaux lourds via la technique de flottaison : On utilise une boite de pétrie dans laquelle est coulé de la paraffine, avec une baguette avec bout arrondit chauffer on va faire des petites cupule (trous) on vient mettre des sels de métaux lourds. On vient retourner la grille sur la goutte et on va mettre en contact l’échantillon, tout cela est fait à l’obscurité donc on retourne un carton autour de la boite de pétrie environ 30min.

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On retire la grille et on rince à l’eau distillé . Et on met à sécher à l’étuve.

Rappel : En blanc = pas d’impact avec réflexion d’électron donc espace vide. En noir réflexion d’électron = espace plein .

C – Préparation de coupes pour le microscope électronique à balayage -

Fixation : avec fixateur non coagulant idem transmission

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Déshydrations : à l’alcool 100

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Dessiccation (plus d’eau) sous-vide : pour évité la déformation de l’échantillon par l’impact des électrons.

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On rentre l’échantillon dans le microscope : un objet massif et on le fait tenir avec une colle

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Métallisation : On doit traiter la surface de l’échantillon pour qu’il émette des électrons secondaires en pulvérisant une fin couche d’alliage. Protocole standard . On peut aussi faire de la cryofracture .

Résumé : On peut s’arrêter après le premier bain de butanol froid, ou les 2 bains de paraffines ( à la fin des 2H de paraffine pure).

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