Protocolo Quantificação de DNA PDF

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Quantificação de DNA. Quais são os reagentes, materiais, equipamentos e métodos utilizados....

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Quantificação de DNA

Introdução A quantificação de DNA envolve a estimativa da sua concentração obtida após a extração, que depende do tipo (sangue, planta, etc.) e quantidade de amostra disponível. Existem diversos métodos de quantificação tem-se a eletroforese em gel de agarose, que permite a resolução de ácidos nucléicos, sendo um método apenas comparativo; a espectrofotometria, realizada por medição da quantidade de luz absorvida pelo DNA; e a utilização do fluorímetro, um equipamento que trabalha com alterações nas características de fluorescência na presença de DNA, um método quantitativo. A quantificação de amostras de ácido nucleico antes da análise é uma etapa importante na Biotecnologia, a fim de verificar a adequação para os testes posteriores, como na PCR. O excesso de DNA em uma amostra de PCR poderá saturar a reação, fazendo com que apareça amplificações inespecíficas que podem dificultar a sua análise. A falta de DNA acarretará na perda de um dos alelos, quando o indivíduo é heterozigoto, ou mesmo na não amplificação dos mesmos. Os ácidos nucléicos absorvem luz no comprimento de onda de 260 nm. Para fazer a leitura no espectrofotômetro, normalmente se utiliza uma diluição em água. A avaliação da quantidade e da pureza das amostras antes da análise tem grande valor por causa dos custos financeiros e de tempo das falhas analíticas. Um espectrofotômetro produz um feixe de luz em um comprimento de onda selecionado, ou cor, e brilha através de uma solução. Um fotômetro registra a quantidade de luz que vem através da solução e registra-o. A concentração da solução pode ser calculada a partir de que valor registado pela equação de Lambert-Beer. Laboratórios clínicos de diagnóstico frequentemente trabalham com quantidades limitadas de amostras biológicas; portanto, não apenas o rendimento de ácido nucléico resultante é frequentemente pequeno, mas a oportunidade de re-isolar os ácidos nucléicos é limitada. O espectrofotômetro NanoDrop® 2000 produzido pela empresa Thermo Scientific analisa amostras de 0,5 a 2 µL com alta precisão e reprodutibilidade. O que apresenta várias vantagens importantes em relação aos espectrofotômetros convencionais, particularmente a capacidade de quantificar os ácidos nucléicos em apenas um microlitro. A análise leva menos de cinco segundos por amostra, enquanto a faixa dinâmica excepcional dos instrumentos significa que a diluição da amostra não é necessária. O sistema de retenção utiliza a tensão superficial para posicionar a amostra entre duas fibras ópticas. Isto permite a medição de amostras altamente concentradas, sem a necessidade de diluições. O espectrofotômetro NanoDrop® 2000 é ideal para: Medição da concentração de ácido nucleico e da pureza das amostras de ácido nucleico < 15000 ng/μL (dsDNA) sem diluição; Análise de proteína (A280, BCA, Bradford, Lowry e Pierce 660 nm); Medição e quantificação de proteínas marcadas com corante fluorescente, conjugados e metaloproteínas; Medidas em culturas de células microbianas; Ensaios cinéticos; Métodos personalizados. O Fluorômetro Qubit® foi desenvolvido e distribuído pela Invitrogen. É um método alternativo para avaliar a concentração de DNA e RNA, marcando a amostra com um marcador fluorescente, que é um corante fluorescente usado para medir a intensidade dos corantes que se ligam a ácidos nucléicos e fluorescem seletivamente quando ligados (por exemplo, fluoróforos e brometo de etídio). Este método é útil para casos em que a concentração é muito baixa para avaliar com precisão pela espectrofotometria e nos casos em que os contaminantes que absorvem a 260 nm impossibilitam a quantificação exata por esse método. Por apresentar maior sensibilidade, o Qubit® é uma melhor alternativa para quantificação do DNA, porém possui custo maior, por necessitar do uso de soluções para a quantificação, e maior tempo de trabalho.

Materiais:  Tubos do tipo Eppendorf 2 mL  Micropipetas (1.000 – 200 – 10 - 2)  Ponteiras plásticas  Lenço de papel

Roteiro Prático  Água Milli-Q autoclavada  Gelo  Vórtex  NanoDrop® 2000  Qubit®

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 Procedimento usando o NanoDrop® 2000 1. Limpar as superfícies superior e inferior óptica do sistema de retenção de amostra do espectrofotômetro pipetando 2-3 µL de água mili-Q autoclavada para limpar a superfície inferior óptica. 2. Fechar o braço da alavanca, garantindo que o pedestal superior entre em contato com a água. Levante o braço da alavanca e limpe ambas as superfícies ópticas com um lenço de papel. 3. Abra o software NanoDrop® e selecione o aplicativo de ácido nucléico. Aplique 2 µL de água mili-Q para realizar uma medição em branco. Abaixe o braço de alavanca e selecione "blank" na aplicação de ácido nucléico. 4. Uma vez que a medição em branco é completa, limpe ambas as superfícies ópticas com um lenço de papel. 5. Aplique 2 µL de amostra de ácido nucléico no pedestal inferior e feche o braço da alavanca. Porque a medida é de volume independente, a amostra só precisa preencher a lacuna entre as duas superfícies ópticas para uma medição a ser feita. 6. Selecione "Measure" no software de aplicação. O software irá calcular automaticamente a concentração do ácido nucléico e as taxas de pureza. 7. Após medição da amostra, rever a imagem espectral para avaliar a qualidade da amostra. Uma amostra de ácido nucleico típico terá um perfil muito característico.  Procedimento usando o Qubit® 1) Qual kit usar? -DNA BR – para amostras de DNA mais concentradas (100 pg/µl – 1.000 ng/µL). -DNA HS – para amostras de DNA menos concentradas (10 pg/µL to 100 ng/µL). 2) Preciso sempre preparar os standards? - Não, se a última calibração tiver sido feita há menos de 1 semana. - Sim, se a calibração for antiga ou se você quiser garantir muita precisão na quantificação. Nesse caso, anote na ficha que foi feita a calibração nessa data e para esse kit. 3) Para quantas amostras faço os cálculos? - O número de amostras + os standards (se for o caso) + 0,2 (se forem mais de 15 amostras pode aumentar esse número para 0,3-0,5) Ex: 8 amostras + 2 standards + 0,2 = cálculos para 10,2 amostras

4) Usar sempre os tubos próprios para o Qubit®. Colocar sempre as amostras primeiro, com bastante atenção, reparando se o volume pipetado foi todo deixado no fundo do tubo. 5) Na hora da leitura, selecionar o kit correto antes. 6) O primeiro número mostrado NÃO É a concentração final. Tem que ir em “calculate sample concentration” para corrigir o valor de acordo com o volume de amostra usado. 7) O resultado é dado em µg/ml, que é a mesma coisa que ng/µl. 2

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