Referat Klaudia Pietrzyk PDF

Preview

Summary

Referat z biochemii...

Description

Klaudia Pietrzyk Grupa 6 Weterynaria

Replikacja DNA u organizmów eukariotycznych Replikacja DNA u organizmów żywych to proces powielania się cząsteczki kwasu deoksyrybonukleinowego, które zachodzi podczas cyklu komórkowego, a dokładnie w fazie S interfazy. Faza ta nazywana międzypodziałową umożliwia zaopatrzenie komórek potomnych w kompletną informacje genetyczną.

Model Replikacji W przypadku replikacji DNA istnieją trzy modele przebiegu DNA, są to: model semikonserwatywny, konserwatywny i przypadkowy. Model samikonserwatywny inaczej nazywany półzachowawczym polega na tym, że nowopowstała cząsteczka DNA posiada jeden łańcuch macierzysty oraz drugi nowopowstały. Model konserwatywny w którym po replikacji otrzymuje się jedna cząsteczkę całkowicie zbudowaną z nowych nici, a drugą całkowicie matrycową. Ostatni model, czyli przypadkowy polega na tym, że nie można określić, która nić jest macierzysta, bo wszystko się miesza tworząc istny chaos.

Badanie Po odkryciu podwójnej nici DNA M. Melselson i F. Stahl chcieli sprawdzić, który z tych trzech modeli jest prawdziwy dla replikacji DNA w organizmach żywych. Do badań wykorzystali komórki drożdży, które hodowano na pożywkach z izotopami N14 i N15 Po

wielu pokoleniach rosnących w pożywce z N15 spowodowało, że wszystkie zasady azotowe miały

ten izotop. Następnie przeniesiono je na izotop N 14 i pozwalano im na wzrost przez kilka pokoleń. DNA tworzone po zmianie pożywki będzie zawierało N 14, ponieważ będzie to tylko jedyny dostępny azot do syntezy DNA. Z każdego pokolenia zebrano próbki, aby je wyekstrahować i oczyścić DNA, następnie mierzono gęstość DNA oraz zawartość obu izotopów dzięki wirowaniu frakcjonującemu.

Pokolenie pierwsze uległo replikacji i posiadało ciężki izotop i lekki, dlatego gęstość w stosunku do pokolenia pierwszego była mniejsza, a każde następne pokolenie posiada większy stosunek izotopu „lekkiego” do izotopu cięższego co potwierdza model semikonserwatywny.

Przebieg replikacji Proces replikacji można podzielić na trzy zasadnicze etapy: inicjacja, elongacja i terminacja.

Inicjacja Przed zapoczątkowaniem replikacji wymagane jest rozplecenie podwójnej nici DNA, które inicjuje enzym topoizomeraza, następnie helikaza rozrywa wiązania wodorowe między nićmi matrycowego DNA, a dokładniej między konkretnymi zasadami azotowymi. Proces rozplatania DNA powoduję powstawanie tzw. skręceniowych naprężeń, powodujące blokowanie dalszego rozplatania DNA. Topoizomeraza I ucina wiązanie fosfodwuestrowe jednego z pasm co powoduje swobody obrót wokół drugiego wiązania i tym samym likwiduje naprężenia. Kontrole nad tym, aby wiązania nie zostały utworzone ponownie sprawują białka wiążące jednoniciowy DNA.

Elongacja Tworzy się miejsce nazywane widełkami replikacyjnymi, które tworzą oczko replikacyjne. Zapoczątkowanie dodawania nukleotydów wymaga dostarczenia energii, która pochodzi od samych nukleotydów. Nukleotydy posiadają trzy grupy fosforanowe, które połączone są wysoko energetycznymi wiązaniami (podobnie jak w ATP). Pęknięcie wiązań uwalnia energie, która jest wykorzystywana do tworzenia wiązania pomiędzy następnym nukleotydem i wydłużającym się łańcuchem. Tworzone są STARTERY, które stanową krótkie odcinki RNA, ok. 5 nukleotydów, dzięki obecności prymazy, które przyłączają się do odpowiednich obszarów, nazywanych miejscami inicjacji replikacji – ori,

których u Eukaryota jest wile, np. u człowieka jest ich do 100 000. Takie rozwiązanie przyspiesza procesy replikacyjne. Następuje przy udziale polimerazy DNA doczepiane są komplementarne nukleotydy do grupy – OH w kierunku 5` do 3`. Taki kierunek powoduje powstawanie nici wiodącej oraz nici opóźnionej. Na nicy wiodącej przebieg replikacji jest zgodny z kierunkiem rozrywania nici co powoduje, że wystarczy jeden starter, lecz na nici opóźnionej kierunek jest przeciwny. Oznacza to, że podczas procesu zostają utworzone fragmenty Okazaki oraz liczne startery, które łączone są za pomocą ligazy DNA (proces wymaga dostarczenia energii głównie z ATP). W komórkach eukariotycznych występuje 5 grup polimeraz:  Pol α – prymaza, wydłuża startery  Pol β – naprawa DNA  Pol δ – główny enzym replikacyjny  Pol ε – replikacja, kontrola cyklu komórkowego, naprawa DNA  Pol γ – replikacja DNA w mitochondriach

Terminacja Następuję wtedy, gdy polimeraza dotrze do telomerów, czyli powtarzających się końcowych fragmentów nici DNA. Usuwane zostają startery dzięki nukleazie DNA oraz łączone są fragmenty Okazaki, a za odbudowywanie DNA (po usunięciu fragmentów RNA) odpowiada naprawcza polimeraza, która (odgrywa rolę także w momencie nastąpienia błędu w kolejności nukleotydów) zastępuję nieprawidłowości właściwymi zasadami. Wracając do telomerów, z każdym cyklem komórkowym chromosomy, na których znajdują się telomery, są skracane, co łączy się z procesami starzenia się komórek. Częściowo temu procesowi zapobiega telomeraza, która jest w stanie, dzięki odwrotnej transkrypcji przy użyciu RNA, odtworzyć brakujące nukleotydy.

Naprawa DNA a mutacje Skala błędu poreplikacyjnego jest bardzo niewielka, ponieważ na straży poprawności stoją polimerazy, włączające odpowiedni nukleotyd, i egzonukleazy, które usuwają z końca – OH błędny nukleotyd, będące częścią systemu napraw źle sparowanych zasad oraz wszelkiego rodzaju procesy napraw rekombinowanych oraz replikacje uszkodzonego DNA.

Naprawa DNA bezpośrednia W procesach tych biorą udział odpowiednie enzymy. Podczas pęknięcia nici DNA do dzieła wkraczają ligazy DNA, które naprawią przerwane wiązania fosfodiestrowe. Do tego procesu wymagany jest nakład energii. Gdy jest to uszkodzenie alkilacyjne DNA dochodzi do metylacji lub etylacji zasad i grup fosforanowych. Reszta metylowa usuwana jest przez metylotransferazy, po usunięciu grupa metylowa przenoszona jest na cysteinę, zawartą w białku, po czym ulega inaktywacji. Jest to zatem system kosztowny, zmuszający komórkę do ciągłej syntezy enzymu w dużych ilościach. Ostatnią możliwością

jest uszkodzenie poprzez fotoreaktywacje. Naprawianiu ulegają fosfodimery pirymidyn powstałych pod wpływem działania promieniowania UV. Katalizowana przez fotoliazę reakcja zależna jest od energii pozyskiwanej z absorpcji światła o długości fali 300–500 nm.

Naprawa DNA pośrednia BER (ang. base excision repair) jest zdolny do korekcji niewielkich uszkodzeń przez wycinanie i naprawianie pojedynczych zasad, które uległy modyfikacjom chemicznym, np. alkilacji, deaminacji. Polega to na tym, że glikozydaza DNA przecina wiązanie β-N-glikozydowe, a następnie usuwa uszkodzoną zasadę tworząc miejsce AP, czyli apurynowe lub apirymidynowe. Następnie endonukleaza AP przecina wiązanie fosfodiestrowe, w miejscu AP, w kierunku 5’ od powstałego uszkodzenia. W ten sposób powstają wolne końce 3’- OH. Do grupy -OH przyłącza się polimeraza DNA I (Pol I), która tworzy nową nić syntetyzowaną na matrycy DNA. U różnych organizmów w procesie tym biorą udział różne rodzaje polimerazy. Podczas kończenia procesu ligaza DNA łączy obie nici i syntetyzuje ostatnie wiązanie fosfodiestrowe.

NER (ang. nucleotide excision repair) działa poprzez wycinanie uszkodzonych nukleotydów usuwa duże uszkodzenia DNA zniekształcające strukturę podwójnej helisy. Białka XPA i XPC rozpoznają uszkodzenie, dzięki temu endonukleazy mogą nacinać nić DNA po obu stronach powstałego błędu. Helikazy rozplatają podwójną helisę przy uszkodzonych nukleotydach, a następnie uwalniają fragment zawierający zmianę. Usunięty odcinek uzupełniany jest dzięki polimerazie DNA, ostatecznie ligazy łączą ze sobą obie nicie.

Naprawa rekombinacyjna, pozwala na naprawę uszkodzeń występujących w obu niciach, nowej, ale także matrycowej. Wykorzystanie tej techniki przez organizm może powodować mutacje ze względu na brak matrycy umożliwiającej odtworzenie zmienionego fragmentu, ewentualnie sprawdzenia poprawności procesu. Polega na łączeniu niehomologicznych końców w przypadku braku homologicznych sekwencji, które mogłyby pomóc odtworzyć ciągłość nici. W procesie bierze udział kompleks białkowy kierujący ligazę na miejsce pęknięcia. W jego skład wchodzą: białko Ku, kinaza białkowa DNA-PKCS, białko XRCC4. Mechanizm ten nie jest dokładny, gdyż w uszkodzonym rejonie powstaje kilkunukleotydowa delecja.

Skutki błędów W momencie, gdy błąd nie zostanie wyłapany prowadzi to do zmiany kolejności nukleotydów, co może doprowadzić do zmiany w chromosomach i ekspresji genów (lub jej braku).

Rodzaje mutacji: 



Typu podstawienia zasad, który to polega na podstawieniu niewłaściwego nukleotydu. Powodować mogą je działanie metabolitów komórkowych oraz na skutek czynników zewnętrznego środowiska. Mutacja może być utajona, jeżeli zamiana nastąpiła w obrębie trójki nukleotydów i wyniku ostatecznym (po translacji i transkrypcji) nie będzie żadnych zmian w białku. Typ zmiany ramki odczytu, powodowane przez delecje albo addycje jednego nukleotydu. Mogą powodować wyłączenie genu albo powstawania innych cech warunkowane przez te geny (niekoniecznie korzystne dla organizmu).

Mutacje mogą zachodzić także w mitochondrialnym DNA, powodując mutacje punktowe i liczne choroby takie jak PEO czyli Zespół przewlekłej postępującej zewnętrznej oftalmoplegii, Zespół Kearnsa-Sayre’a, Zespół mitochondrialnej encefalomiopatii dotyczącej układu nerwowego, żołądka i jelit, czy Zespół szpikowo-trzustkowy Pearsona.

Bibliografia: 

Replikacja DNA i naprawa DNA, Anna Kurcek – e-biotechnologia.pl

  

Model replikacji DNA: eksperyment Meselsona-Stahla - pl.khanacademy.org Zarys biologii molekularnej genu Replikacja DNA - http://wiki.biol.uw.edu.pl Replikacja DNA – materiały współfinansowane z UE Mechanizm wierności replikacji DNA, Anna Bębenek

...