Relatório de autoclave 2 PDF

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Relatório da aula prática autoclave...

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Resumo

A prática Autoclave, meios de cultura e manobras assépticas tratou sobre o funcionamento e manuseio do equipamento autoclave que tem por função a esterilização por calor úmido de utensílios utilizados no laboratório de microbiologia. Foi demonstrada a maneira correta de utilizar o equipamento, a temperatura ideal e o tempo necessário para uma esterilização eficiente. Tratou da preparação correta de meios de cultura, utilizando caldos nutritivos e a autoclave para esterilização do mesmo. E por fim referiu-se a manobras assépticas, no qual foi mostrado o modo de utilizar o bico de Bunsen de forma correta na inoculação de microorganismos e técnicas de segurança.

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1. Introdução A prática realizada tratou dos seguintes temas: autoclaves, meios de cultura e manobras

assépticas.

Autoclaves

são

equipamentos utilizados

para

esterilização

(destruição de todas as formas de vida microbiana por um processo que utiliza agentes químicos ou físicos) por calor úmido. Constituem-se basicamente de uma câmara em aço inox, com uma ou duas portas, possuem válvula de segurança, manômetros de pressão e um indicador de temperatura. Elas podem ser divididas em dois tipos: autoclave de pré-vácuo onde o ar é removido pela formação de vácuo, antes da entrada do vapor, assim quando este é admitido, penetra instantaneamente nos pacotes e autoclave gravitacional onde o ar é removido por gravidade, assim quando o vapor é admitido na câmara, o ar no interior desta que é mais frio (mais denso), sai por uma válvula na superfície inferior da câmara. Pode ocorrer a permanência de ar residual neste processo, sendo a esterilização comprometida principalmente para materiais densos ou porosos. As autoclaves podem ainda ser do tipo horizontal ou vertical. As do tipo horizontal são atualmente as mais utilizadas, pois possuem paredes duplas separadas por um espaço onde o vapor circula para manter o calor na câmara interna durante a esterilização, evitando a formação de condensado. Apresenta maior eficácia no processo de esterilização. As do tipo vertical possuem um custo relativamente menor, por serem bem mais simples em sua construção e não são tão eficientes, pois dificultam a circulação do vapor, a drenagem do ar e a penetração do vapor devido à distribuição dos pacotes a serem esterilizados, que ficam sobrepostos. A utilização de calor em ambiente úmido é um dos métodos mais eficazes de destruição de microrganismos. A morte das células microbianas por ação do calor úmido resulta da desnaturação das proteínas e da desestabilização da membrana citoplasmática. Ocorre quando as células são sujeitas a temperaturas superiores à temperatura máxima de crescimento dos microrganismos em causa. A autoclave torna-se uma câmara com vapor de água saturado à pressão de 1 atm acima da pressão atmosférica, a que corresponde, em locais ao nível do mar, a uma temperatura de ebulição da água de 121ºC.

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No laboratório de microbiologia, é usual sujeitar o material a ser esterilizado a 121ºC durante 15 minutos, de modo a assegurar a morte de todas as formas de vida bacterianas, incluindo a dos endósporos bacterianos mais resistentes ao calor que as células vegetativas. Contudo, o tempo necessário para se esterilizar convenientemente os materiais a esta temperatura depende da natureza do material a esterilizar e/ou do seu volume. O calor úmido sob pressão é utilizado na esterilização de meios de cultura que não contenham componentes termolábeis, na esterilização de materiais de laboratório utilizados nos estudos de Microbiologia. É também usado na descontaminação de roupas e instrumentos médicos e cirúrgicos, assim como de diversos materiais, reutilizáveis ou descartáveis, contaminados com culturas de células viáveis, antes de serem lavados ou colocados no lixo. A produção do vapor utilizado na esterilização requer alguns cuidados como a água utilizada para a produção do vapor. Esta deve estar livre de contaminantes em concentração que possa interferir no processo de esterilização, danificar o aparelho ou os produtos a serem esterilizados. Meios de cultura são composições de substâncias que fornecem nutrientes necessários para o desenvolvimento de microrganismos. Sendo favorecido o crescimento, é possível a identificação desses organismos através das suas atividades bioquímica e metabólica. Além dos nutrientes, existem condições ambientais para o crescimento microbiano, como temperatura, pH, umidade, presença ou não de oxigênio, entre outros. Os meios de cultura são classificados de acordo com seu estado físico, podendo ser sólido, quando possui agentes solidificantes como o ágar; semissólido, quando a consistência de ágar e/ou gelatina é intermediária, ou líquido, quando não possui solidificantes, caracterizando-os como caldos. Devido à diversidade dos microrganismos, existem vários meios de cultura específicos que atendem às exigências para o desenvolvimento de cada um. Os meios básicos permitem o crescimento, porém não atendem a nenhuma condição nutricional específica de um determinado microrganismo. São exemplos de meio de cultura simples o caldo e o ágar simples. 3

Já os meios especiais ou complexos possuem condições específicas que atendem às exigências de determinado microrganismo, pois contêm substâncias que propiciam a produção de enzimas e secreções específicas de determinados microrganismos, e que impedem o crescimento de outros que não são de interesse de análise. Um exemplo de meio de cultura especial é o Manitol, um meio salino com indicador de pH que tem a sua cor alterada quando ocorre o processo de fermentação e produção de ácido. Nesse meio é possível a identificação da bactéria Staphylococcus aureus. Ainda, é estabelecida uma classificação funcional para os diferentes meios de cultura, que podem ser para:  Pré-enriquecimento: para amostras que sofreram algum processo físico ou químico.  Enriquecimento: desenvolvimento de bactérias gerais.  Seletivo: inibem o crescimento de alguns microrganismos e propiciam o desenvolvimento de outros.  Diferencial: permite a diferenciação de microrganismos parecidos.  Triagem: avalia as atividades metabólicas, permitindo a identificação de vários microrganismos.  Identificação: para realização de provas, bioquímicas e funções fisiológicas do organismo a ser identificado.  Dosagem: determinações de aminoácidos, vitaminas e antibióticos.  Contagem: determinação quantitativa da população microbiana.  Manutenção: conserva os microrganismos em laboratórios. Manobras assépticas são técnicas que impedem a entrada de microrganismos onde estes não desejados, ou seja, garantem boa assepsia. Algumas técnicas de manobra asséptica são:  Trabalhar em áreas submetidas previamente a limpeza e desinfecção.  Trabalhar dentro da “Zona de Segurança” do Bico de Busen.  Flambar ao rubro alça ou agulha e após inoculação.  Deixar esfriar o instrumento antes de obter o inóculo, dentro da zona de segurança. 4

 Flambar rapidamente a boca dos tubos contendo micro-organismos ou meio estéril, imediatamente após abri-los, ou antes de fechá-los. A tampa nunca deve ser colocada sobre a bancada, sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão durante a inoculação.  Desembrulhar material estéril dentro da Zona de segurança. 2. Objetivos  Dominar o funcionamento e manuseio da autoclave;  Preparação de meios de cultura;  Aprender a executar manobras assépticas;  Utilização correta do bico de bunsen;  Aprender a forma correta de se realizar uma inoculação. 3. Materiais  Autoclave  Bastão de vidro  Bico de Bunsen  Isqueiro  Placa de Petri  Ágar nutritivo  Béquer  Balão volumétrico  Alça de Inoculação  Água destilada  Fogão  Tubo de ensaio  Tela de amianto

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 Proveta  Balança analítica  Espátula  Papel pardo  Fita indicadora  Fita crepe  Algodão e gaze  Barbante 4. Metodologia Procedimento: Para preparo do meio de cultura foi utilizado 200 ml de água destilada e Ágar Nutritivo de concentração de 23g para cada 1L. Então, por essa proporção, tem-se: 23g ------------ 1000 mL de água destilada Xg ------------- 200 mL X = 4.6g Pesou-se 4.6g de ágar na balança analítica, e então diluiu-se no béquer, adicionando aos poucos à água destilada, misturando sempre. Depois de misturada a substância foi levada ao fogão e aquecida, em fogo baixo, até se obter uma mistura semitransparente, bem diluída, por um tempo de 5 a 10 minutos, sem permitir ebulição. Levou-se novamente à bancada, para despejo do líquido no balão volumétrico, então vedou-se com algodão, gaze e papel pardo, amarrou-se com barbante e fita crepe e colocou-se um pedaço da fita indicadora, e por fim o recipiente foi identificado e levado à autoclave, juntamente com as placas de petri, igualmente vedadas. Para a esterilização, foi utilizada temperatura de 120ºC à pressão de 1atm por 15 minutos. 6

Após a utilização da autoclave, o foco da prática foi a realização de manobras assépticas. Trabalhar em áreas submetidas previamente à limpeza e desinfecção, deixando somente o que será necessário para a prática; trabalhar dentro de um raio de 15 cm do Bico de Bunsen (Zona de Segurança); flambar a alça ao rubro antes e depois da inoculação; deixar esfriar o instrumento antes de obter o inóculo, dentro da zona de segurança; flambar rapidamente a boca dos tubos contendo os microrganismos ou o meio estéril imediatamente após abri-los, ou antes de fechá-los. A tampa nunca deve ser colocada sobre a bancada, sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão durante a inoculação. Todo o material trabalhado foi manipulado dentro da Zona de Segurança.

5. Resultados e Discussões Ao término da preparação do meio de cultura, o caldo nutritivo é levado na autoclave para esterilização e após o tempo determinado fica isento de micro-organismos indesejáveis e já pode ser utilizado como meio de cultura para um micro-organismo específico.

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6. Conclusão

Devido a esta prática bem encaminhada e executada, foi possível uma excelente assimilação do conteúdo. Na parte em que se refere à execução de manobras assépticas com tranquilidade e exatidão. O meio de cultura foi preparado exatamente como instruído no modo de preparo do ágar e após ser devidamente embalado e rotulado foi levado para autoclavagem. Por fim, foi estudado o funcionamento da autoclave no processo de esterilização.

7. Referências Bibliográficas Boas práticas, Autoclaves e a esterilização por calor úmido. Disponível em: . Acesso em: 11 de novembro de 2015. Portal

Educação,

Meios

de

culturas

de

microrganismos.

Disponível

em:

. Acesso em: 11 de novembro de 2015. PANTOJA, L.A. Autoclave, meio de cultura e manobras assépticas.

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