Resumen Extracción del ADN genómico bacteriano (practica #2) PDF

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Resumen de laboratorio de biología molecular...

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Extracción del ADN genómico bacteriano Primero comenzamos tomando la biomasa de E.coli del respectivo cultivo al centrifugarlo, la biomasa es el conjunto o grupo de bacterias a las cuales se les va a realizar el lisado y se les va a extraer el ADN genómico. mantenemos el pellet de la biomasa dentro del tubo eppendorf y luego a este numero de bacterias las suspendemos en agua milliQ, el agua milliQ es un agua desionizada y así se prevé que las bacterias no realicen la lisis, como la E.coli es una bacteria gram negativa (posee dos membranas celulares e intermedio a estas una pared de peptidoglucano), se le añade una pequeña cantidad de SDS para así degradar la membrana debido a que desestabiliza a los componentes anfipáticos (fosfolípidos) y solubilizan las proteínas que se hallan dentro de estas membranas, consiguientemente el tubo eppendorf se agita con la ayuda del vortex, luego le añadimos de igual manera una pequeña cantidad de lisozima A y lo volvemos agitar con ayuda del vortex, la lisozima A es una enzima hidrolítica que escinde los enlaces n-glucosídicos dentro de la pared celular de peptidoglucano produciendo así su degradación y permitiendo que la bacteria como respuesta a la turgencia con su ausencia de pared celular haga lisis y se reviente. esta mezcla dentro del tubo la incubamos durante una hora a 37°c, luego tomamos el lisado, le añadimos el cloroformo-alcohol isoamílico y una sal (se puede realizar solo con el cloroformo-alcohol isoamílico), comúnmente se utiliza el acetato de sodio, esta mezcla se agita en el vortex hasta que se torne de color blanco y se utiliza con el fin de realizar un centrifugado y que se precipiten las proteínas, la presencia de la sal por medio del proceso denominado “salting out” hace que esta atraiga al agua para formar enlaces con ella y entonces las proteínas se aglomeran y esto le brinda más densidad, potenciando y haciendo más fácil su precipitación. en el tubo se van encontrar tres fases, una acuosa, otra sólida y una fenólica, el solido corresponde a las proteínas y el acuoso mantiene al ADN y otras sustancias (Lípidos y sales), esta fase acuosa es retirada y llevada hacia otro tubo eppendorf donde se le va a suministrar isopropanol u otro alcohol (preferiblemente isopropanol por su efectividad) con el fin de deshidratar al ADN debido a que este hace que el ADN se torne insoluble y se precipite, el ADN deshidratado forma una especie de motitas o hilitos, se reposa para dejar que la mezcla se asiente y con la ayuda de una centrifugación este se precipita, se toma al ADN y se descarta el sobrenadante con todas las sustancias restantes. ya casi para finalizar este ADN genómico se lava con la ayuda de etanol, el cual después del lavado se elimina y se mete el tubo en la incubadora para evaporar los residuos de este alcohol. Finalmente tenemos al ADN genómico bacteriano extraído, este ultimo se resuspende en agua milliQ o agua ultrapura, con el objetivo de mantenerlo para su posterior utilización...