LAB 2 frotis bacteriano PDF

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Apuntes de frotis bacteriano...

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LABORATORIO Nº 2. PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO OBJETIVOS: 1. Conocer los principios generales de las técnicas de esterilización y entender la importancia de las condiciones de asepsia para el control de contaminaciones microbianas en el laboratorio. 2. Adquirir habilidad en la elaboración correcta de un frotis bacteriano, siguiendo las indicaciones de la guía de laboratorio. 3. Valorar la importancia de la elaboración de un frotis bacteriano en la realización de tinciones de bacterias. INTRODUCCIÓN Cuando se trabaja con cultivos microbianos, la técnica aséptica se utiliza para prevenir la introducción de organismos adicionales al cultivo. Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfección y esterilización para limitar o eliminar la presencia de microorganismos. La esterilización es un método de eliminación total de cualquier forma viviente, mientras que la desinfección es un proceso que elimina únicamente formas vegetativas de los microorganismos. La esterilización con calor seco y húmedo son los procedimientos de mayor utilización en microbiología. El calor seco desnaturaliza las enzimas y destruye a los microorganismos por oxidación, por ejemplo al ponerlos directamente a la flama de un mechero o en horno a 150-180° C durante 2 horas. Estos métodos se aplican principalmente en la esterilización de asas de inoculación y todo tipo de material de vidrio y quirúrgico. Los procesos con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones y cultivos bacterianos que se desechan. El más recomendable es la autoclave en el que se utiliza vapor de agua a presión para alcanzar temperaturas de 121 °C. El material se deja a esta temperatura durante 15 minutos para asegurarse de la destrucción de endosporas, que son las estructuras bacterianas más resistentes al calor. Para el caso de materiales plásticos es recomendable el uso de gases como oxido de etileno o con radiaciones gamma. Las superficies generalmente se desinfectan con radiaciones U.V. o compuestos químicos en forma líquida como: los fenoles, compuestos cuaternarios de amonio (alquildimetil bencilamonio), formaldehído, alcoholes, halógenos y detergentes. A menudo es necesario tomar una muestra de bacterias de un tubo y colocarlas en otro. El proceso requiere cuidado y precisión, y se lleva a cabo siguiendo la técnica aséptica para evitar que la bacteria en el tubo contamine el área de trabajo o a la persona que lleva a cabo la transferencia.

Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijación de una extensión bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y bacteriana y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber. MATERIALES:  1 caja de agar nutritivo  Marcador indeleble  2 tubos con caldo nutritivo estéril (por alumno)  2 tubos con agar nutritivo inclinado estéril (por alumno)  Gradilla  Asa de siembra  Encendedor  1 tubo con cultivo en caldo  1 tubo con cultivo en agar inclinado PROCEDIMIENTO. Parte 1: Realización del Frotis 1. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mínima gota de agua, que resulta suficiente. 2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea que quede bastante extendida para facilitar su secado. 3. Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos. 4. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el porta pues las células pueden deformarse o romperse. Parte 2: Fijación de las Bacterias al Portaobjetos 1. Por calor: Pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos. Dejar enfriar el porta entre los pases.

2. Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden ser observadas al microscopio, aunque carecen de contraste. Lo normal es continuar con el proceso de tinción. Parte 3: Tinción del Frotis Bacteriano 1. Cubrir el frotis con abundante colorante y dejarlos actuar durante el tiempo que indique el protocolo de cada tinción concreta. Suele oscilar entre 1 y 5 minutos. En ocasiones el colorante tiñe sólo en caliente, por lo que el tiempo que dure su actuación se deberá sostener el portaobjetos con unas pinzas sobre la llama del mechero para que humee el colorante, pero teniendo mucho cuidado de que no llegue a hervir ya que se produciría la destrucción de las células. 2. Lavar la preparación con agua para eliminar el colorante. Esta operación se realiza inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte superior de manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido directamente sobre él, pues podría arrastrar parte del frotis consigo. Eliminar la máxima cantidad de agua de los portaobjetos golpeándolos por su canto con cuidado contra la superficie de la mesa de trabajo. 3. Secar el porta presionando entre dos papeles de filtro, pero en ningún caso se debe frotar el porta. 4. Observar la preparación al microscopio llegando hasta el máximo aumento. Si se quiere montar de forma definitiva no se debe usar ahora el aceite de inmersión. Parte 4: Montaje Definitivo de la Preparación 1. La técnica siguiente es de aplicación para cualquier preparación microscópica que se desee montar de forma definitiva. Se anotará en un extremo del portaobjetos el contenido de la preparación, la fecha y, en su caso, el nombre del alumno. 2. Pasar sucesivamente los portaobjetos por las siguientes soluciones manteniéndolos un mínimo de 5 minutos en cada baño. La serie de alcoholes puede modificarse en función de la disponibilidad de los reactivos, pero el objetivo es que la preparación quede totalmente deshidratada. Escurrir bien el reactivo antes de introducirlo en el siguiente baño. a. b. c. d. e.

Alcohol de 70° Alcohol de 95º Acetona pura Acetona-xilol (1:1) Xilol

Montar la preparación. Emplear bálsamo de Canadá, euparal o algún medio de montaje sintético. Utilizar preferiblemente cubreobjetos de 22x22 mm.

ANALIZA Y COMPRENDE. 1. ¿Qué es un frotis? Método de exploración microscópica de un fragmento de tejido o secreción que consiste en realizar una extensión sobre un portaobjetos y examinarla con el microscopio. 2. ¿Con qué finalidad se fija la muestra de microorganismos en el porta objetos?  evita la deformación de las células con el colorante.  Protege la subestructura fina y la morfología de los microorganismos delicados de mayor tamaño 3. ¿Qué importancia tiene teñir las muestras bacterianas?  Identificar la bacteria (Gram positiva o Gran negativa)  indicar el tratamiento correcto (los antibióticos no funcionan por igual para bacterias Gram positivas que Gram negativas).  proporciona suficiente contraste para poder visualizarlos con un microscopio de campo claro. 4. ¿Por qué razón no debes compartir el mechero de Bunsen? 5. ¿Cuál es la razón para flamear los tubos antes y después de cada transferencia? 6. ¿Por qué debes evitar el usar el pulgar para sostener las tapas durante una transferencia? 7. Explica por qué debes evitar que el asa llena de inóculo toque la boca del tubo fuente o del tubo a ser inoculado. Para evitar el riesgo de contaminación 8. Cuando tomas un inóculo de un tubo con agar inclinado. ¿por qué es necesario tocar una parte estéril del agar con el asa antes de tocar el crecimiento bacteriano? 9. ¿Por qué el asa debe ser flameada antes y después de todos los procedimientos de siembra? Para evitar la contaminación de los microorganismos en estudio con otros microorganismos que estuvieran presentes en el filamento metálico. BIBLIOGRAFÍA. 

SOLOMON, E.; BERG, L; MARTÍN, D; VILLEE, C. 1998. Biología. Editorial McGraw-Hill Interamericana. México. Cuarta edición.

Figura 1: procedimiento de transferencia de inoculo de tubo a tubo....