Metabolismo Bacteriano PDF

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informe de microbiologia...

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LAB 5 METABOLISMO BACTERIANO, DETERMINACION DE VIABILIDAD Y PUREZA DE CEPAS DE REFERENCIA

DANIELA MACEA RAMOS

Dra. LISY GRACIA HERRERA Dra. ANDREA DE JESUS DORIA PEDRAZA

HORARIO: MARTES 7Am-10 Am

UNIVERSIDAD DE CORDOBA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE BACTERIOLOGIA INTRODUCCION A LA MICROBIOLOGIA MONTERIA- CORDOBA 2018 INTRODUCCIÓN

Una característica clave de un sistema vivo es la capacidad de dirigir las reacciones químicas y organizar las moléculas en estructuras específicas: crecimiento. Las células microbianas están constituidas de sustancias químicas de una amplia diversidad de tipos, y cuando la célula crece, todos sus constituyentes químicos aumentan en cantidad apropiada. Los elementos químicos básicos de una célula, viene del exterior, pero estos elementos químicos son transformados por la propia célula en los constituyentes característicos. Dependiendo de la fuente de energía que utilicen, se agrupan los microorganismos en clases metabólicas. Los microorganismos pueden ser agrupados en clases nutricionales de acuerdo a como satisfacen sus requerimientos de: energía, H+/ e- y carbono. [ CITATION Esq13 \l 3082 ] Las cepas de referencia son cultivos conservados y distribuidos por Colecciones de Cultivo, cuyos microorganismos se encuentran definidos como mínimo a nivel de género y especie. Los laboratorios microbiológicos deben utilizar en el control de sus técnicas y de los medios implicados las cepas indicadas en las normas de referencia (por ejemplo la norma ISO 11133 parte 1 y 2). Los microorganismos se relacionan con su medio, se reproducen, mutan, muere Debido a que en estos casos el material de referencia es un ser vivo, es necesario que el laboratorio lo gestione y conserve de forma adecuada, estandarizando sus lotes de cepas de reserva y de trabajo, cuantificando la concentración microbiana con métodos apropiados y garantizando las condiciones de conservación más adecuadas.

OBJETIVOS 

Comprender la importancia de los distintos metabolismos bacterianos como base para distinguir los diferentes géneros y especies.



Efectuar las pruebas bioquímicas necesarias para la identificación de bacterias.



Esclarecer los conceptos de viabilidad, pureza y cepas bacterianas.

MARCO TEÓRICO Las bacterias son los organismos más pequeños que tienen la maquinaria requerida para el crecimiento y la replicación. Están compuestas, como las células eucariotas, por proteínas, polisacáridos, lípidos, ácidos nucleicos, entre otros. Estas macro-moléculas pueden formar parte de estructuras celulares más complejas, como la pared celular y la membrana plasmática. El crecimiento bacteriano se define como el aumento ordenado de todos los constituyentes químicos de la célula. Es un proceso complejo que supone la replicación de todas las estructuras y componentes celulares a partir de nutrientes exógenos. El término metabolismo se refiere al conjunto de reacciones químicas que se producen en la célula y tiene tres funciones específicas. La primera es obtener energía química del entorno y almacenarla, para luego usarla en diferentes funciones celulares. La segunda es convertir los nutrientes exógenos en unidades precursoras de los componentes macromoleculares de la célula bacteriana. Y la tercera función es formar y degradar moléculas necesarias para cumplir funciones celulares específicas, por ejemplo: movilidad y captación de nutrientes. El metabolismo se produce por secuencias de reacciones catalizadas enzimáticamente y se divide en anabolismo y catabolismo. El proceso por el cual la célula bacteriana sintetiza sus propios componentes se conoce como anabolismo y resulta en la producción de nuevo material celular; también se denomina biosíntesis. La biosíntesis es un proceso que requiere energía, por lo tanto las bacterias deben ser capaces de obtenerla de su entorno para crecer y, eventualmente, multiplicarse. El conjunto de reacciones degradanticas de los nutrientes para obtener energía o para convertirlos en unidades precursoras de la biosíntesis, se conoce como catabolismo Aunque hay distintos tipos de fermentaciones, todas llevan a una oxidación parcial de los átomos de carbono del substrato inicial y liberan, por lo tanto una pequeña parte de la energía potencial contenida. Las condiciones físicas y químicas del medio donde el microorganismo se encuentra afectan marcadamente sus actividades. La comprensión de cómo influye el ambiente sobre el crecimiento nos ayuda a explicar la distribución de los microorganismos en la naturaleza y hace posible diseñar estrategias que favorezcan el crecimiento o que nos permita controlarlo. Las bacterias como grupo, son extremadamente versátiles y tienen gran capacidad para utilizar una

amplia gama de nutrientes que van desde compuestos inorgánicos simples, a compuestos orgánicos más complejos. [ CITATION Val14 \l 3082 ] PROCEDIMIENTO

RESULTADO Y ANÁLISIS A) Generación de cultivos de trabajo 1) Viabilidad y pureza a partir de un cultivo de E. coli. Coloración de Gram A partir de un cultivo de E. coli realizando el procedimiento de la coloración de Gram, se observaron bacilos Gram negativos (se determinó un cultivo puro con Características fenotípicas estables).

2) Siembra por agotamiento e incubación E. coli

En agar nutritivo y agar EMB se realizó una siembra por agotamiento a partir de un cultivo de E. coli y posterior a esto se llevó a incubación por 24 horas, en lo anterior se observa que hubo crecimiento y además presenta las características correspondientes a este tipo de microorganismo (E. coli) refiriéndose a los medios de cultivos empleados. Lo cual se determina como cultivo viable. 3) A) Inoculación en medio TSI Inoculando E. coli en un medio TSI (Triple Sugar Iron o bien sea, triple azúcar hierro) se obtuvieron los siguientes resultados; inicialmente el color de este medio era un rojo ladrillo, luego de llevar a incubación por 24 horas, se observó; formación de grietas y burbujas en medio del cultivo, lo que corresponde a la formación de gas, dado que el proceso de fermentación se efectuó con producción de este y tanto en la parte inclinada como en el fondo del tubo de ensayo se tornaron de color amarillo, indicando así que existió fermentación de lactosa y sacarosa, lo cual da a entender que la bacteria empleada es fermentadora de estos azucares. El agar triple azúcar hierro contiene tres carbohidratos (glucosa, lactosa y sacarosa). Se emplea para la diferenciación de Enterobacteriaceae en este caso el microorganismo referente a E. coli. Permite la diferenciación de los organismos fermentadores de glucosa, lactosa y/o sacarosa, con formación de ácido y gas, además de la detección de la producción de sulfuro de hidrógeno.

B) Inoculación en medio SIM Este medio se utiliza para determinar la producción de sulfuro, formación de indol y movilidad de los microorganismos entéricos. La detección de motilidad es posible gracias a la naturaleza semisólida del medio. Un crecimiento que se propague hacia el exterior a partir de la línea central de inserción de la muestra, indica que el organismo de prueba es móvil. Se inoculo E. coli en el medio SIM (Medio de sulfuro indol para movilidad) y se llevó a incubación, finalmente se observó que no hubo movilidad del microorganismo ya que se mantuvo en la misma línea de siembra. Prueba de indol En este mismo cultivo de SIM mediante la adición de un reactivo químico (reactivo de Kovacs) este es usado para determinar la capacidad de un organismo para dividir el indol de la molécula de triptófano; posteriormente al periodo de incubación, se determinó la producción de indol. Lo cual resulto positivo, indicado por una línea de color rosa- rojiza. Determinadas bacterias pueden oxidar el aminoácido triptófano usando enzimas intracelulares denominadas colectivamente ‘triptofanasa", lo que conduce a la producción de indol. La presencia o ausencia de formación de índoles se usa para la identificación bacteriana. C) Inoculación en agar Simons Citrato Mediante la inoculación de E. coli en este medio, dio como resultado un test negativo, ya que inicialmente este se tornaba de un color verde oscuro, el cual se mantuvo luego de la incubación, lo que indica que esta bacteria no usa el citrato como única fuente de carbono, y esto corresponde a una de las características de esta: no utilización de citrato como fuente de carbono y no producción de acetoína. Este medio es utilizado para la diferenciación de enterobacterias en base a la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía. En el medio de cultivo, el fosfato monoamonico es la única fuente de nitrógeno y el citrato

de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxilico.

2) viabilidad y pureza a partir de cultivo S. aureus 1. Coloración de Gram Tomando una pequeña cantidad de un cultivo de S. aureus se realizó un frotis en una lámina portaobjetos y luego se sometió al proceso de tinción de Gram, se observaron cocos Gram positivos. Se determinó un cultivo puro con características fenotípicas estables.

2. Siembra por agotamiento e incubación. En un medio de cultivo manitol sal y agar nutritivo se realizó una siembra de S. aureus. Llevándolo a incubación por 24 horas, donde se obtuvo como resultado un crecimiento de este, pureza, por la obtención de un solo microorganismo, indicando la viabilidad del microorganismo.

3. A) prueba de catalasa y valoración de calidad del reactivo peróxido de hidrogeno. Se tomó una asada del microorganismo S. aureus y se hizo un frotis en una lámina portaobjetos y se agregaron 2 gotas de peróxido de hidrogeno al 3%, observándose inmediatamente la aparición de burbujas y efervescencia. Los estafilococos y los micrococos se diferencian de los estreptococos y los enterococos por esta prueba. Esta prueba detecta la presencia de enzimasCatalasa o Peroxidasa. S. aureus es una bacteria anaerobia facultativa.

Además de estos resultados se denoto que el reactivo usado se encuentra en óptimas condiciones. b) prueba de coagulasa y valoración de la calidad del reactivo plasma citratado de conejo. En un tubo de ensayo con plasma citratado de conejo se adiciono una asada de S. aureus y se llevó a incubación por 4 horas, dando como resultado formación de coágulos, lo que indica que la prueba es positiva. La prueba de la coagulasa es sencilla y tiene una especificidad muy alta consiste en la búsqueda del factor de aglutinación.

A su vez prueba que el reactivo usado se encuentra en buen estado. 3) Valoración de la calidad de reactivos a) Reactivo de Kovacs: empleado en el medio con agar SIM, lo cual proporciono la aparición de un anillo rojo, indicando reacción positiva, por lo que se determina que está en condiciones buenas. b) Reactivo de oxidasa: tomando una asada de un cultivo de Pseudomona aeruginosa se llevó a una cinta de reactivo de oxidasa en la cual se observó un cambio de color a azul oscuro, indicando que la prueba es positiva y que la tirilla o cinta de reactivo funciona correctamente.

PRE- LABORATORIO 1. Describa el fundamento de las pruebas de catalasa, coagulasa y oxidasa. R/ Catalasa: La enzima catalasa se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromos (proteínas que participan en el transporte de energía química). Su función es descomponer el peróxido de hidrogeno, desprendiendo el oxígeno libre. La catalasa descompone el peróxido de hidrogeno u oxida sustratos secundarios. El peróxido de hidrogeno es un producto final oxidativo de la degradación aerobia de azucares. Coagulasa: Esta prueba se realiza para diferenciar especies dentro del género Staphylococcus. La prueba de la coagulasa se utiliza para la identificación definitiva de S. Aureus y con frecuencia se usa para indicar virulencia o patogenicidad. El objetivo es probar la capacidad de un microorganismo de coagular el plasma por la acción de la enzima coagulasa (estafilocoagulasa). Oxidasa: Se basa en la producción bacteriana de una enzima oxidasa intracelular. La reacción de oxidasa se debe a un sistema de citocromo oxidasa que activa la oxidación del citocromo reducido por el oxígeno molecular. El sistema citocromo está presente en organismos aerobios y permite a estos utilizar el oxígeno como aceptor final de hidrogeno para reducir el oxígeno molecular a peróxido de hidrogeno en el último eslabón de la cadena respiratoria. 2. Mencione 2 bacterias catalasa negativo. R/: Streptococcus spp. , cocos del grupo Streptococcus. 3. Mencione 2 sistemas comerciales de identificación de enterobacterias.

R/: 1) BBL, ENTEROTUBE II(Becton Dickinson): Es un sistema para usar en la identificación de Enterobacterias, definida como bastones Gram Negativos, aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa negativa. 2) Quintet 3H de Diagnostics Pasteur para Enterobacterias. 4. ¿En qué consiste un cepario bacteriano? R/: Un Cepario es una colección de microorganismos: bacterias, hongos, virus y parásitos, principalmente, así como parte o productos de ellos; ácidos nucleicos, proteínas o toxinas que se han conservado y utilizado en el diagnóstico, la constatación y la investigación biomédica. En otras palabras un cepario es donde se almacenan una gran cantidad de especies de bacterias de la misma especie (cepas). CONCLUSIÓN Todos los seres vivos llevan a cabo el procesamiento de los nutrientes que los mantienen vivos. Todo este conjunto de procesos, se le conoce como metabolismo, las bacterias están dentro de esos organismos que necesitan distintos nutrientes, fuentes de energía, carbono, etc. para llevar a cabo su crecimiento y desarrollo. Por ende, las diferentes pruebas bioquímicas empleadas son de gran importancia para la determinación e identificación de los microorganismos tanto para el conocimiento general, como para saber a nivel clínico que especie y que genero de dicho microorganismo está presente en la patología dada. La utilización de cepas de referencia ayuda a estas identificaciones, ya que permite conocer las características fenotípicas y genotípicas tomándolas como guía al momento de diferenciar un microorganismo.

BIBLIOGRAFÍA Esquivia, V. (31 de julio de 2013). Metabolismo microbiano. Obtenido de https://es.slideshare.net/CamiloBeleo/metabolismo-bacteriano-24817583 Valera, G. (4 de mayo de 2014). Fisiología y metabolismo bacteriano. Obtenido de http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/FisiologiayMetabolismoBacteriano.p df...