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Informe correspondiente al recuento bacteriano por UFC/mL y por cámara de Neubauer....

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UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS ESPE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA INFORME DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Nombre: Génesis Recalde Nrc: 4861

Fecha: 2019-06-26

1. TÍTULO: Recuento de microalgas y bacterias presentes en muestra de cerveza empleando la cámara de Neubauer y el recuento en caja Petri. 2. RESUMEN: El recuento de microorganismos es empleado ampliamente para determinar la cantidad de especímenes presentes en una muestra. Para ello es necesario aplicar diferentes métodos de recuento microbiano. El presente informe se emplearon dos métodos, uno directo y otro indirecto. El ensayo se realizó con el objetivo de aplicar los métodos antes mencionados y determinar el número de microalgas en una muestra empleando la cámara de Neubauer y las UFC/mL de bacterias de muestra de cerveza presentes en caja Petri. Para el conteo de microalgas se empleó la cámara de Neubauer y se observó con el objetivo de 10x. Para el conteo de UFC/mL, se realizaron cinco diluciones. De la cuarta y quinta dilución se tomaron 0,10mL y se sembraron en dos cajas Petri con agar nutriente y dos cajas Petri con EMB, respectivamente. Finalmente, en el caso de las microalgas no se pudo reconocer células individuales en la cámara de Neubauer por aglutinamiento de las mismas. Y en el recuento de UFC/mL se determino la presencia de 1,16x107 UFC/mL en caja Petri con EMB y con una dilución de 10-4. En caja Petri con agar nutriente y con dilución 10-4 y 10-5 se observó el crecimiento masivo de bacterias. En caja Petri con agar EMB y dilución 10-5 no se observó el crecimiento de bacterias. 3. PALABRAS CLAVE: Conteo directo e indirecto, Neubauer, dilución, UFC. 4. INTRODUCCIÓN: A lo largo de los años, poseer información del número, actividad y desarrollo de los microorganismos en su hábitad ha sido de gran utilidad para conocer y entender las relaciones entre las poblaciones microbianas de un ecosistema (Vela, 2007). Es por esto que se han desarrollado diferentes técnicas de conteo microbiano. Existes dos tipos de conteo: directo e indirecto. El conteo directo permite determinar el número de células microbianas, por observación directa en el microscopio (Ramírez, Parra, & Andalucy, 2016). Uno de los métodos de conteo directo más empleando es el recuecuento con la cámara de Neubauer. La cámara de Neubauer o hemocitómetro es un aparato de vidrio que posee dos superficies reticuladas (retículos) para el conteo de las células y dos columnas laterales por encima del retículo (Gomes, 2011). Sobre ella se pone la suspensión de la muestra de la que se quiere determinar el número de microorganismos y, al ser cubierta con el cubreobjetos, se delimita un volumen exacto sobre cada cuadro (Sanz, 2011). El volumen en esta cámara es de 104 mm3 y esto se debe a que de la cámara tiene una profundidad de 1mm. A pesar de que se cuenta directamente célula por célula, una desventaja que tiene la cámara

es que no se diferencian entre células viables y no viables (Prescott, Harley, & Klein, 2004). El conteo indirecto se define como la evidencia presuntiva de microorganismos por medio de la búsqueda de productos metabólicos en ensayos cultivables (Vela, 2007). Un método de conteo indirecto es el recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) en caja Petri. Para ello se emplea la siembra por profundidad. Esta técnica utiliza diferentes diluciones con el objetivo de que las bacterias se encuentren en menos concentración cada vez que se realice una dilución. Se elije contar UFC puesto que las colonias no siempre provienen de una sola célula. Una ventaja de este método es que se cuentan el número de células viables (Prescott, Harley, & Klein, 2004). 5. OBJETIVOS: Objetivo General: • Realizar un recuento de microalgas y bacterias presentes en muestra de cerveza empleando la cámara de Neubauer y el recuento en caja Petri. Objetivos Específicos: • Determinar el número de microalgas empleando la cámara de Neubauer. • Determinar las UFC/mL presentes en las cajas Petri formadas a partir de bacterias de muestra de cerveza empleando diferentes diluciones. 6. HIPÓTESIS El recuento con cámara de Neubauer permiten contar células individuales mientras que el recuento en cajs Petri permite contar UFC/mL. 7. MATERIALES Y MÉTODOS 7.1. Recuento con cámara de Neubauer Se colocó el cubreobjetos sobre la cámara de recuento de Neubauer. Con la ayuda de una pipeta Pasteur se tomó muestra de microalgas diluídas en solución. Se colocó la muestra en la cámara de recuento de Neubauer. Se contó el número de células en el cuadrado central empleando el objetivo 10x. 7.2. Recuento en caja Petri Se realizaron cinco diferentes diluciones. Para la primera se tomó 1mL de muestra de cerveza y se colocó en 9mL de agua peptonada contenida en un tubo de ensayo. De esta dilución se tomó 1mL y se colocó en un segundo tubo con 9mL de agua peptonada. El proceso se repitió hasta tener cinco tubos de ensayo. Del cuarto y quinto tubo se tomaron 0.1mL y se colocaron respectivamente en dos cajas Petri con agar nutriente y dos con EMB. Se esterilizó una varilla acodada de vidrio empleando alcohol al 70% y la llama del mechero. Con la varilla se extendió la muestra por toda la superficie del medio de cultivo. Se incubó a 37ºC por 24 horas. Se observaron los resultados. 8. RESULTADOS 8.1. Recuento con cámara de Neubauer No se observó la presencia de células individuales de microalgas. Solo se pudo observar conglomerados de células.

Figura 1. Recuento de microalgas con cámara de Neubauer

8.2. Recuento en cajas Petri Se contaron 116 UFC en caja Petri con medio de cultivo EMB. La dilución empleada en este conteo fue 104. En agar nutriente con diluciónes 10-4 y 10-5 no se observó la formación de UFC sino que se produjo el crecimiento masivo de bacterias. En EMB con dilución 10-5 no se observó la fomración de UFC ni crecimiento de bacterias.

Figura 1. Recuento de UFC en caja Petri con EMB y con dilución de 10-4

𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟'𝑑𝑒'𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 = ' 102 𝑈𝐹𝐶 116'𝑈𝐹𝐶 ∙ 102 𝑈𝐹𝐶 = = 1,16 ∙ 10: 𝑚𝐿 𝑚𝐿 0,1𝑚𝐿 9. DISCUSIÓN El conteo microbiano empleando la cámara de Neubauer es un método que permite determinar el número de células viables y no viables. Para que las células puedan identificarse con claridad en cada uno de los cuadrados de la cámara es necesario realizar una dilución adecuada. Según (Arredondo & Voltolina, 2007) es suficiente una dilución 1:100. La muestra empleada tenía una dilución mayor por lo que el conteo de las células en la cámara no fue posible. Además, (Bastidas, 2014) propone que se debe tomar volúmenes pequeños empleando una micropipeta, el volumen recomendado es 10 µL. En el ensayo se empleó una pipeta Pasteur y no se tomó un volumen específico por lo que los resultados no fueron favorables.

Para el conteo de UFC/mL en caja Petri, se obtuvo resultado solo en la caja Petri con medio de cultivo EMB y con una dilución de 10-4. En esta se contaron 116 UFC, que según (Prescott, Harley, & Klein, 2004) son suficientes para que los resultados sean confiables puesto que el número de colonias por placa debe ser entre 30 y 300 para que sea un valor estadísticamente fiable. En cuanto a las cajas Petri con agar nutriente en las que no se pudo hacer el conteo de UFC/mL, una de las razones por las que existió un crecimiento masivo es que este es un medio de cultivo utilizado para propósitos generales por lo que usualmente se da un crecimiento masivo de microbios (Britania, 2016). Además, pudo haber existido un mal uso del mechero para esterilizar la varilla acodada permitiendo que crezcan masivamente bacterias ajenas al estudio. Finalmente por lo discutido anteriormente se rechaza la hipótesis planteada. A pesar de que el resultado del conteo de UFC/mL haya sido favorable para la caja con EMB y una dilución de 10-4, no se logró contar más colonias en las otras placas; y en el caso del recuento empleando la cámar de Neubauer no se pudo contar células individuales debido a la conglomeración de estas. 10. CONCLUSIONES • Se realizó un recuento de microalgas y bacterias presentes en muestra de cerveza empleando la cámara de Neubauer y el recuento en caja Petri. • No se pudo determinar el número de células de microalgas en la cámara de Neubauer puesto que hubo conglomeración de estas. • Se determinaron 1,16x107 UFC/mL en placa Petri con EMB empleando una dilución de 10-4. En el caso de la placa Petri con agar nutriente empleando diluciones de 10-4 y 10-5 se observó el crecimiento masivo de bacterias. En la placa Petri con EMB y con una dilución de 10-5 no se observó la formación de UFC ni el crecimiento masivo de bacterias. 11. BIBLIOGRAFÍA Arredondo, B., & Voltolina, D. (2007). CONCENTRACIÓN, RECUENTO CELULAR Y TASA DE CRECIMIENTO. En Métodos y Herramientas Analíticas en la Evaluación de la Biomasa Microalgal (págs. 21-29). Bastidas, O. (2014). Conteo Celular con Hematocitómetro. Uso Elemental del Hematocitómetro. Celeromics, 1-6. Britania. (2016). Nutritivo Agar. Obtenido de https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a284 46b169d8.pdf Gomes, R. (2011). HEMOGRAMA. CÓMO HACER E INTERPRETAR. AMOLCA. Prescott, L., Harley, J., & Klein, D. (2004). Microbiología. Madrid-España: McGraw-Hill Interamericana. Ramírez, J., Parra, J., & Andalucy, A. (2016). Análisis de técnicas de recuento de Microorganismos. Programa de Microbiología. Universidad Libre Seccional Pereira., 12-18. Sanz, S. (2011). PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA. Logroño-España: Universidad de la Rioja.

Vela, A. (2007). EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LOS SISTEMAS PRODUCTIVOS SOBRE LA DENSIDAD DE LOS MICROORGANISMOS EDÁFICOS EN SUELOS DEL EJE CAFETERO EN LAS CUENCAS DEL LOS RÍOS LA VIEJA Y EL OTÚN. Obtenido de https://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis28.pdf...