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Resumo sobre os exames parasitológicos de fezes ...

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UNIVERSIDADE REGIONAL DO CARIRI – URCA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE – CCBS DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - DCBio CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

CARLA BEATRIZ DANTAS SOARES

MÉTODOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE PARASITAS NA FEZES

CRATO-CEARÁ 2019 A maioria das doenças parasitárias não pode ser diagnosticada apenas pelos exames

médicos, por isso as investigações laboratoriais tornam-se necessárias para definir se o paciente está ou não infectado com o parasita e se estiver, qual a espécie do mesmo. O laboratório desempenha um papel importante no diagnóstico das doenças parasitárias, sendo a chave para a seleção do medicamento adequado ao tratamento. O exame parasitológico de fezes, comumente chamado de EPF, tem por objetivo diagnosticar as diferentes formas evolutivas dos parasitas e que foram eliminadas nas fezes, sendo eles, os ovos e larvas de helmintos, oocistos, cistos e trofozoítos de protozoários. Por tratar-se de um exame relativamente rápido e de baixo custo, o exame parasitológico de fezes é amplamente utilizado na rotina laboratorial para demonstração dos parasitos intestinais por microscopia ótica. Não existe um método capaz de diagnosticar, ao mesmo tempo, todas as formas parasitárias. Alguns métodos são mais gerais, permitindo o diagnóstico de vários parasitos intestinais, outros são métodos específicos, indicados para um parasito em especial. Na maioria dos pedidos de EPF, a suspeita clínica não é relatada, e o exame é feito por um dos métodos gerais. Quando é solicitada a pesquisa de um parasito que exige a execução de um método específico, tanto este como o método geral devem ser executados. Desta forma, o EPF ficará mais completo, pois será feita a pesquisa dos vários parasitos intestinais e não apenas daquele solicitado. Tal conduta se justifica pelo fato de vários parasitos intestinais determinarem sintomas semelhantes. Se for executado apenas o método específico, outros parasitos intestinais porventura presentes, não serão diagnosticados. Após uma solicitação de EPF é necessário saber o modo de vida de cada paciente, bem como os fatores epidemiológicos do meio em que ele vive, criando hipóteses quanto ao diagnóstico. A coleta do material solicitado para análise deve ser feita corretamente sem perigo de contaminação. Fatores como água, urina ou mesmo o papel podem conter parasitas, ou seja, as coletas devem ser totalmente livres de possíveis contaminações para que não ocorra um falso diagnóstico. Neste caso, os laboratórios disponibilizam frascos que dependendo das circunstâncias, poderá vir com conservantes, caso a amostra possa demorar até o momento da análise. Dentre estes conservadores temos o MIF, SAF e FORMOL 10% que manterá o material viável para análise, caso não seja disponibilizado tais conservantes é indispensável manter o material em temperaturas de (5 a 10°c) e levar a amostra o mais breve possível ao laboratório. O diagnóstico será dividido em macroscópico e microscópico: Exame Macroscópico: Observação a olho nu quanto a consistência da amostra, coloração, odor, presença de elementos anormais como sangue e/ou muco e vermes adultos; Exame Microscópico: Realizado através de métodos específicos que determinam, com maior precisão, a realidade da infecção. Visualiza ovos ou larvas de helmintos, assim como cistos, trofozoítos ou oocistos de protozoários, dando uma visão mais ampla acerca do parasito. Pode ser realizado através de métodos quantitativos ou qualitativos; Método Quantitativo: Realizado por meio da contagem dos ovos nas fezes, avaliando, através disso, a intensidade do parasitismo. Não é muito utilizado porque a dose do futuro medicamento do paciente não leva em conta a carga parasitária, mas sim o peso corporal do paciente. Mesmo assim, entre os métodos quantitativos, o de Kato-Katz é o mais empregado; Método Qualitativo: É o mais utilizado, demonstra a presença das formas parasitárias. Pode haver necessidade de recorrer a processos de enriquecimento para concentrar o número

das formas parasitárias eliminadas nas fezes, pois na maioria das vezes esse número é pequeno. O EPF pode ser executado por meio de muitos métodos, os mais utilizados serão descritos passo a passo abaixo. Métodos de Identificação de Parasitas nas Fezes: ● Exame Direto a Fresco: 1. Colocar duas a três gotas de salina a 0,85% em uma lâmina de vidro. 2. Tocar com a ponta de um palito em vários pontos das fezes, transferindo uma pequena porção para a lâmina de microscopia. 3. Espalhar as fezes, fazendo um esfregaço e examinar ao microscópio. A espessura do esfregaço não deve impedir a passagem de luz. O uso de lamínula é facultativo.

● Método de Hoffman, Pons e Janer ou Lutz (Sedimentação Espontânea): 1. Recipiente contendo amostra fecal; 2. Colocar 2g em outro recipiente (frasco de Borrel) + 5ml de água e triturar bem (bastão de vidro ou madeira); 3. Coar a emulsão através de gaze ou tela para um cálice cônico; 4. Completar o volume do cálice com água e misturar bem. Sedimentar por uma hora. Desprezar o líquido sobrenadante e substituir por água limpa. Repetir até que o sobrenadante fique claro; 5. Com uma pipeta Pasteur, retirar uma pequena amostra do sedimento do vértice do cálice, colocar em uma lâmina, cobrir com uma lamínula e examinar ao microscópio.

● Método de MIFC ou de Blagg (sedimentação por centrifugação): 1. Coletar as fezes recém-emitidas em líquido conservante de MIF. 2. Homogeneizar bem. 3. Filtrar a suspensão de fezes em gaze cirúrgica dobrada em quatro, em um copo plástico descartável. 4. Transferir 1 a 2 ml do filtrado para um tubo cônico de centrifugação com capacidade para 15 ml. 5. Acrescentar 4 a 5 ml de éter sulfúrico e agitar vigorosamente (importante para desengordurar o material). 6. Centrifugar por 1 minuto a 1.500rpm. 7. Descolar a camada de detritos da parede do tubo, com ajuda de um bastão; 8. Inverter o tudo e desprezar o líquido, mantendo-o com a boca voltada para baixo, até limpar a sua parede, utilizando um bastão de vidro (ou palito de picolé) contendo algodão na

extremidade. 9. Acrescentar ao sedimento gotas de solução salina e/ou lugol. 10. Inverter o tubo em uma Lâmina, deixando escoar todo o sedimento. Se houver muito sedimento, utilizar uma pipeta para coletá-lo e preparar, nesse caso, pelo menos duas lâminas de cada material. 11. Cobrir com lamínula e encaixar com as objetivas de 10 e/ou 40x.

● Método de Faust (Centrifugação-Flutuação em sulfato de Zinco): 1. Diluir as fezes em água filtrada; 2. Homogeneizar; 3. Filtrar através de gaze dobrada em quatro, em um copo plástico, transferir para um tubo de Wasserman (tubo de hemólise); 4. Centrifugar por 1 minuto a 2.500 rpm; 5. Desprezar o líquido sobrenadante e ressuspender o sedimento em água; 6. Repetir as operações 4 e 5 mais duas ou três vezes até que o líquido sobrenadante fique claro; 7. Desprezar a água sobrenadante e ressuspender o sedimento com uma solução de sulfato de zinco a 33% densidade de 1,18 g/ml. 8. Centrifugar novamente por um minuto a 2.500 rpm, por um minuto. 9. Os cistos e alguns oocistos de protozoários e os ovos leves, presentes na amostra fecal, estarão na película superficial. Recolher a película com a alça de platina, colocar em uma Lâmina, acrescenta uma gota de lugol e cobrir com lamínula. 10. Examinar com as objetivas 10 e /ou 40x.

● Método de Willis (Flutuação Espontânea): 1. Colocar 10 g de fezes em um frasco Borrel (pode ser usado o próprio frasco no qual as fezes foram enviadas). 2. Diluir as fezes em solução saturada de açúcar ou sal (NaCl). 3. Completar o volume até a boca do frasco. 4. Colocar na boca do frasco uma Lâmina, que deverá estar em contato com o líquido. 5. Deixar em repouso por 5 minutos. 6. Ao final desse tempo, retirar rapidamente a lâmina, voltando a parte molhada para cima. 7. Levar ao microscópio e examinar com objetiva de 10 e /ou 40x. O uso da lamínula é facultativo.

● Método de Baermann-Moraes: 1. Colocar 8 a 10 g de fezes em uma gaze dobrada em quatro ou em uma peneira. 2. Colocar o material assim preparado sobre um funil de vidro contendo um tubo de borracha conectado à extremidade inferior de sua haste. 3. Obliterar o tubo de borracha com uma pinça de Hoffman e adicionar, ao funil, água aquecida (45°C) em quantidade suficiente para entrar em contato com as fezes. 4. Deixar 1 hora em repouso. 5. Ao final desse tempo, coletar 5 a 7 ml da água em um tubo de centrífuga abrindo-se a pinça. 6. Centrifugar a 1.000 rpm por 1 minuto. 7. Coletar o sedimento sem desprezar o líquido sobrenadante e examinar ao microscópio (10x). Caso larvas sejam detectadas, deverão ser coradas com lugol e observadas com a objetiva de 40x para identificação. ● Método de Rugai: 1. Retirar a tampa do recipiente que acondiciona as fezes e envolvê-lo em uma gaze dobrada em quatro, fazendo uma pequena “trouxa”. 2. Colocar o material assim preparado com a abertura voltada para baixo, em um cálice de sedimentação, contendo água aquecida (45°C) em quantidade suficiente para entrar em contato com as fezes. 3. Deixar 1 hora em repouso. 4. Coletar o sedimento no fundo do cálice com a ajuda de uma pipeta. 5. Examinar no microscópio com a objetiva de 10x. 6. Corar as larvas com lugol e observá-las com o maior aumento, para identificação. OBS: fezes frescas, formadas ou pastosas e coletadas no mesmo dia do exame; refrigeração diminui a sensibilidade; fezes diarreicas ou em conservante não se utiliza esse método.

● Método de Sheather (Flutuação no açúcar): 1. Misturar, em partes iguais, fezes e solução fisiológica de NaCl – Sal de cozinha. 2. Filtrar a suspensão em gaze dobrada em quatro partes. 3. Recolher o filtrado em um tubo de centrífuga, completando até a metade. 4. Completar o tubo com solução saturada de açúcar. 5. Cobrir o tubo com um pedaço (lamínula) de plástico ou papel celofane transparente e fixálo com uma gominha. 6. Homogeneizar bem por agitação. 7. Caso necessário, completar o volume com solução saturada de açúcar até o líquido

alcançar a borda do tubo. 8. Centrifugar por 5 minutos a 1500 rpm ou deixar em repouso durante 1 hora. 9. Retirar a lamínula, colocar sobre uma lâmina e examinar com a objetiva de 40x.

● Método de Kato - Katz: 1. Homogeneizar material fecal; 2. Transferir uma porção de fezes para uma folha de papel e tamisação em tela de 105 malhas por polegada quadrada, recolher material tamisado com uma espátula; 3. Transferir fezes tamisadas para um cartão perfurado disposto sobre uma lâmina de vidro, preenchendo todo o espeço (volume fecal correspondente a cerca de 0,045g); 4. Retirar o cartão e cobrir a alíquota de fezes com uma lamínula de celofane previamente embebida em solução glicerinada de verde malaquita; 5. Inverter a lâmina sobre uma superfície lisa e comprimir as fezes de forma a se obter um esfregaço com cerca de 22mm de diâmetro.

● Método Stoll-Hausheer: 1. Utilizar frasco do tipo Erlenmeyer, com o gargalo contendo indicações correspondentes a 56 e 60 ml. 2. Colocar no frasco solução de NaOH (hidróxido de sódio) 0,1, até a marca inferior, correspondente a 56 ml. 3. Juntar fezes até que o nível do líquido alcance a marca superior correspondente a 60 ml. 4. Introduzir no frasco 10 pérolas de vidro, fechar o recipiente com rolha de borracha e agitar fortemente, a fim de obter uma suspensão bastante homogênea. 5. Após a agitação, retirar 0,15 ml da suspensão, colocar em lâmina, cobrindo com lamínula de 22x40 mm. 6. Contar o número de ovos em toda a preparação, utilizando a objetiva de 10x. 7. Calcular o número de ovos por grama de fezes, multiplicando por 100 o valor encontrado.

● Coloração pela Hematoxilina Férrica: 1) Filtrar as fezes, conservadas em Schaudinn ou SAF, em gaze dobrada quatro vezes. 2) Transferir cerca de 2 ml para um tubo e centrifugar por um minuto a 1.500 rpm. 3) Desprezar o sobrenadante, acrescentar solução salina a 0,85%, homogeneizar e centrifugar

novamente. 4) Repetir a operação até obter um sobrenadante límpido. 5) Desprezar o sobrenadante e acrescentar, ao sedimento, duas gotas de soro humano inativado. 6) Misturar bem e fazer esfregaços finos sobre lamínulas. A lamínula deve ser presa a um suporte de borracha pequeno (pode ser utilizada a borracha que serve de rolha) por meio de um entalhe, para facilitar o manuseio e a identificação do material. Desta forma, é possível a coloração de várias amostras ao mesmo tempo. Para manusear as lamínulas usam-se pinças de madeira, pois o fixador de Schaudinn ataca metais. 7) Sem deixar secar o esfregaço, colocar a lamínula com o esfregaço voltado para baixo, em uma placa de Petri contendo o fixador de Schaudinn com 5% de ácido acético por 10 minutos. 8) Passar a lamínula com o esfregaço voltado para cima para as placas de Petri subseqüentes, contendo os seguintes reagentes: a) álcool 70% (para retirar o excesso de fixador) 2 minutos. b) álcool 70% iodado, isto é, contendo algumas gotas de tintura de iodo até atingir a cor de vinho do porto (para reagir com o mercúrio) 5 minutos. c) álcool 70% (para precipitar o mercúrio) 2 minutos. d) lavar em água destilada (para retirar o excesso de mercúrio) 1 minuto. e) alúmen de ferro 2,5% (mordente que fixa o corante) 10 minutos. f) lavar em água destilada (para retirar o excesso de ferro) 1 minuto. g) hematoxilina 0,5% (corante) 5 minutos. h) lavar em água destilada (para retirar o excesso do corante) 5 minutos. i) alúmen de ferro 2,5% (diferenciador). Obs: O esfregaço deve permanecer nessa solução até atingir uma coloração lilás clara azulada. j) lavar em água destilada 1 minuto. k) álcool 70% (desidratar) 2 minutos. l) álcool 80% (desidratar) 2 minutos. m) álcool 95% (desidratar) 2 minutos. n) álcool absoluto (desidratar) 2 minutos. o) álcool-salicilato (para preparar o material para diafanizar) 2 minutos. p) salicilato de metila (duas trocas) um minuto cada.

9) Montar em lâmina de vidro com bálsamo-do-Canadá ou em resina sintética com a lamínula, contendo o esfregaço, voltada para baixo. 10) Deixar secar e examinar com objetiva de imersão.

● Método de Henriksen e Pohlenz (Derivado de Ziehl-Neelsen): 1. Preparar o esfregaço delgado com parte do material obtido após concentração. 2. Deixar à temperatura ambiente. 3. Fixar com álcool metílico por 5 minutos. 4. Deixar secar à temperatura ambiente. 5. Corar com corante de Kinyoun (a frio), durante 1 hora. 6. Lavar com água corrente. 7. Diferenciar com solução aquosa de ácido sulfúrico a 2% (30 segundos a 1 minuto). 8. Lavar com água corrente. 9. Corar o fundo com verde-malaquita a 5% por 8 minutos. 10. Lavar com água corrente e secar. 11. Examinar com objetiva de imersão (100x).

● Método da Safranina Modificada: Usado para coloração de oocistos de Cryptosporidium parvum, Isospora belli e Cyclospora cayetanensis. 1. Preparar um esfregaço delgado com parte do material obtido após concentração (Método de MIFC, com centrifugação por 8 a 10 minutos, ou método de Sheather). 2. Deixar secar à temperatura ambiente. 3. Mergulhar as lâminas em uma solução aquosa de safranina a 1% e aquecer no forno de micro- ondas, com potência total (650 w), por 30 segundos. 4. Lavar em água corrente por 30 segundos. 5. Mergulhar as lâminas em uma solução aquosa de safranina a 1% ou em solução aquosa de verde-malaquita, por 1 minuto. 6. Lavar em água corrente por 30 segundos e secar. 7. Montar com resina sintética.

● Coloração pelo Chromotrope: 1. Agitar a mistura de fezes e conservante. 2. Utilizar 10µL das fezes preservadas em formol a 10% e preparar um esfregaço na lâmina.

3. Secar em temperatura ambiente. 4. Fixar com álcool metílico absoluto – 5 minutos. 5. Mergulhar no corante Chromotrope por 90 minutos. 6. Descorar em solução ácido-álcool por 1 a 3 segundos. 7. Lavar com etanol a 95%, mergulhando o esfregaço várias vezes na solução. 8. Colocar 2 vezes no etanol a 100% por 3 minutos cada vez. 9. Deixar secar, montar em resina sintética e examinar na objetiva de 100x

● Método de Graham (Fita Durex):

Indicado para diagnóstico de Enterobius vermicularis e Taenia sp. 1. Fixar em uma lâmina, um pedaço de 5 a 6 cm de fita adesiva transparente, colocando, nas duas extremidades, tiras de papel aproximadamente 4cm, que servirão de suporte para segurar e para identificação do material. 2. Destacar a fita lâmina e colocar sobre o fundo de um tubo de ensaio com o lado adesivo voltado para fora. 3. Abrir a prega anal do paciente e encostar, vária vezes, o lado adesivo da fita, na região perianal. 4. Distender a fita sobre uma lâmina de microscopia, com o lado adesivo voltado para baixo (como se fosse uma lamínula). 5. Examinar ao microscópio com a objetiva 10x....