Revisión de métodos espectroscópicos y elaboración de curvas estándar de proteína PDF

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metodo de lowry, bradford, cuantificacion de proteina LDH aislada en pechuga de pollo. ...

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Revisión de métodos espectroscópicos y elaboración de curvas estándar de proteína. Bioquímica experimental Resumen En esta práctica se determinó la concentración de una muestra problema, realizando una curva patrón con distintas concentraciones de albúmina de suero bovino (BSA) contra la absorbancia leída a 750 nm. Determinar la concentración de la muestra fue posible mediante el uso del método colorimétrico Lowry el cual se basa en dos reacciones químicas. La primera reacción es la reducción de los iones de cobre en condiciones alcalinas, lo que forma un complejo con los enlaces peptídicos. La segunda, es la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu por el complejo cobre-enlace peptídico, la cual causa un cambio de color a azulado en la solución, con una absorción en el rango de 650 a 750 nm. Una vez realizada la curva patrón fue posible transpolar la absorbancia obtenida en la muestra problema y determinar su concentración mediante la gráfica, o sustituyendo en la ecuación de la recta y=mx+b despejando x. Palabras clave BSA: La albúmina sérica bovina o BSA (Bovine Serum Albumine ) es una proteína globular aislada del suero bovino que se utiliza en numerosas aplicaciones bioquímicas debido a su estabilidad y falta de interferencia en las reacciones biológicas.El proceso de obtención es por shock térmico y el producto se presenta en su forma liofilizada o en solución. (1) https://www.dsflab.com.ar/albumina-bovina Método de Lowry: El principio del método se basa en que ciertos aminoácidos como tirosina, triptófano y cisteína reaccionan en un medio alcalino con ácido fosfotungsténico y ácido molíbdico del reactivo de Folin (color amarillo) para dar un complejo incoloro que se puede reducir mediante una reacción lenta con fenol en un complejo de coloración azul detectable por espectrofotometría entre 600 y 900 nm (con una absorbancia máxima a 740 nm). Curva patrón: Es un método muy utilizado en química analítica para determinar la concentración de una sustancia (analito) en una muestra desconocida, sobre todo en disoluciones. El método se basa en la relación proporcional entre la concentración y una determinada señal analítica (propiedad). https://curiosoando.com/que-es-una-curva-de-calibracion Espectrofotometría: La espectrofotometría es un método científico utilizado para medir cuanta luz absorbe una sustancia química, midiendo la intensidad de la luz cuando un haz luminoso pasa a través de la solución muestra, basándose en la ley de Beer-Lambert. Esta medición también puede usarse para medir la cantidad de un producto químico conocido en una sustancia. https://elespectrofotometro.com/espectrofotometria/ Introducción A partir de la construcción de una curva de calibración es posible obtener la concentración de una muestra problema, una curva de calibración es una representación gráfica de una señal que se mide en función de la concentración de un analito. Esta técnica se lleva a cabo

comparando una propiedad conocida del analito, contra los estándares de concentración conocida. Existen una gran variedad de métodos para determinar la cantidad de proteína en una muestra de tejidos o fluidos. El método de Lowry es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas en donde a la muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, esto ocasiona un cambio de color a azulado en la solución, con absorción en el rango de 650 a 750 nm, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer: A=εlC. La cantidad de proteína en la muestra puede ser estimada utilizando una curva de calibración con una solución de una proteína estándar seleccionada, tal como la BSA. Esta práctica tiene como objetivo aplicar un método espectrofotométrico para medir la concentración de una proteína, construyendo una curva de calibración en donde se establece que a mayor color, mayor concentración de proteínas. Materiales y métodos La construcción de una curva de calibración para obtener la concentración de una muestra problema es un estudio analítico, en el cual a partir de una muestra stock de concentración conocida se realizan diluciones para poder obtener una regresión lineal, de la cual se puede extrapolar para obtener la concentración de muestras problema. Se proporcionaron 10 microtubos, de los cuales a 8 microtubos se añadieron los siguientes reactivos,H2O, albúmina de suero bovino (BSA) a una concentración de 1 mg/mL, reactivo A y Reactivo B, posteriormente se mezcló todo en el vortex y se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente. A los 2 microtubos restantes se les añadió: H2O, Reactivo A, Reactivo B y muestra problema, el paso siguiente fue mezclar y dejar incubando por 30 minutos a temperatura ambiente. Una vez transcurrido este tiempo se midieron sus absorbancias en un espectrofotómetro previamente configurado a 750 nanómetros, colocando primero el control, ajustando con este la medición de los demás celdas. Se colocó cada una celda en el espectrofotómetro en orden creciente de concentración, se anotó la absorbancia y posteriormente se realizo una grafica (no tomando en cuenta los valores de nuestras muestras 9,10) y se obtuvo la regresión lineal del modelo obtenido.

Resultados

Gráfico 1. Curva patrón concentración de BSA vs Absorbancia para la determinación de concentración de proteínas para una muestra problema. Ecuación obtenida: y= A= 0.0203x + 0.0909 Cantidad de proteína (μg) x= (y-b)/m = (0.199-0.0909)/0.0203 = 5.45 μg Concentración de proteína: C= cantidad de proteína/ volumen añadido= 5.45μg /25 μL =0.218 μg/μL Tabla 1. Determinación de concentraciones en muestras problema. Tubo

A750nm

Cantidad de proteína (μg)

Concentración (μg / μL)

9

0.199

5.45

0.218

10

0.464

18.7

0.374

Gráfico 2. Curvas patrón de cada equipo. Concentración de BSA vs. Absorbancia Tabla 2. Coeficiente de variación calculado para la curva de calibración de BSA por el Método de Lowry. Tubo

A750nm promedio

C.V.

1

0

2

0.194

0.274

3

0.317

0.277

4

0.443

0.225

5

0.447

0.309

6

0.618

0.256

7

0.634

0.336

8

0.738

0.175

Discusión

Se realizó una curva de calibración mediante el método de Lowry es un método colorimétrico,el cual se basa en dos reacciones químicas. La primera reacción es la reducción de los iones de cobre en condiciones alcalinas, lo que forma un complejo con los enlaces peptídicos (reacción de Biuret). La segunda, es la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu por el complejo cobre-enlace peptídico, la cual causa un cambio de color a azulado en la solución, con una absorción en el rango de 650 a 750 nm,se realizó la curva

de calibración de soluciones de concentración conocida, obteniendo la siguiente regresión lineal y= A= 0.0203x + 0.0909 con una r2 =0.96, siendo un valor muy confiable debido a que no se presenta una gran dispersión de datos, a partir de la ecuación de la recta se determinó la cantidad de proteína en las muestras 9 y 10, obteniendo un valor de 5.45μg para muestra 9 y 18.7μg para muestra 10, finalmente se obtuvo la concentración en estas dos muestras problema, obteniendo los siguientes valores, para el tubo 9 la concentración obtenida fue de 0.218 μg / μL y para el tubo 10 0.374 μg / μL ambos valores entran en el intervalo de detección de Lowry 10-1000 μg/ μL

Cuestionario 1. ¿Qué finalidad persigue el científico al escribir y publicar un artículo científico? Comunicar los resultados de investigaciones, ideas y debates de una manera clara, concisa y fidedigna; la publicación es uno de los métodos inherentes al trabajo científico. 2. Investiga cómo se lleva a cabo el diseño de un experimento e incluye ¿qué son las variables independientes, las dependientes y las del control? Se deben seguir las siguientes etapas: a) Definir los objetivos del experimento, b) Identificar todas las posibles fuentes de variación, c) elegir una regla de asignación del material utilizado a las condiciones de estudio (tratamientos), d) Especificar las medidas con las que se trabajará, el procedimientos experimental y anticiparse las as posibles dificultades, e) Ejecutar un experimento piloto, f) Especificar el modelo, g) Esquematizar los pasos del análisis, h) Determinar el tamaño muestral, i) Revisar las decisiones anteriores y modificarlas si se considera necesario. Variable independiente: Es aquella característica o propiedad que se supone ser la causa del fenómeno estudiado. En investigación experimental se llama así, a la variable que el investigador manipula. Variable dependiente: Propiedad o característica que se trata de cambiar mediante la manipulación de la variable independiente. Variable de control: Posee fuerte influencia sobre la variable dependiente y ningún efecto conocido sobre la variable independiente. Se le identifica en el momento de la planeación. En los estudios observacionales su control se realiza mediante los criterios de elegibilidad, es decir, criterios de exclusión y criterios de inclusión. 3. ¿Qué estructura debe tener una hipótesis? Debe contener la predicción de lo que se espera que ocurra en el experimento y fundamentar por qué se piensa que ocurrirán de esa manera. 4. ¿Cuáles son las secciones de un reporte científico? Resumen del contenido, introducción o antecedentes, métodos, resultados, discusión, conclusiones y referencias.

5. ¿Qué diferencia(s) hay entre la sección de resultados y la discusión? En la sección de resultados se presenta de manera concisa y descriptiva los hechos sin analizarlos, generalmente contiene figuras, como diagramas, tablas, gráficas, cuadros o mapas que pueden ser muy útiles para mostrar o enfatizar la información en un reporte. En la discusión se explican los resultados del estudio con base en la literatura científica existente y se evalúa si lo encontrado en el estudio tiene un significado práctico, biológico, y/o está relacionado con otro fenómeno. 6. ¿Qué información bibliográfica deben contener las referencias, si son libros, artículos o catálogos o páginas de internet? Según las Normas de Vancouver: Libros: Autor/es. Título. Volumen. Edición. Lugar de publicaciónt: Editorial; año. Artículos o catálogos: Autores del artículo (6 autores máx et. al.). Título del artículo. Abreviatura del a revista. Año; Volumen (número):páginas. Artículo de revista en internet: Autores del artículo (6 autores máx et. al.). Título del artículo. Abreviatura del a revista [internet]. Año [fecha de consulta]; Volumen (número): páginas. Disponible en: URL del artículo. Páginas de internet: Sede Web [internet]. Lugar de publicación: Editor; Fecha de comienzo [Fecha de última actualización; fecha de nuestra consulta]. Disponible en: URL de la web. Cuestionario 1. Investiga qué factores contribuyen en la desviación de la línea recta al graficar la absorbancia contra concentración (desviaciones a la ley de Beer). La proporcionalidad entre la absorbancia y la concentración únicamente se cumple para disoluciones muy diluidas, observándose desviaciones más o menos acusadas al aumentar la concentración. Las desviaciones a la Ley de Beer pueden ser instrumentales: Radiación no monocromática, radiación parásita y errores en la lectura. Pueden ser químicas, tal es el caso de: Influencia del disolvente,influencia de la temperatura, impurezas en los reactivos,interacción entre especies absorbentes e influencia del equilibrio ya sea ácido base, complejos o dimerizaciones. 2. ¿Cuáles son los principales métodos colorimétricos usados en la determinación de proteínas? Ácido bicinconínico (562 nm), Bradford o azul brillante de Coomassie(470nm) y Método de Lowry (750 nm) 3. ¿Qué sustancias pueden interferir con la determinación de proteínas por el método de Lowry? Detergentes y agentes reductores.

4. Investiga cuál de los siguientes métodos es más sensible y menos costoso para determinar la concentración de proteínas de una muestra: Lowry, Absorbancias 280 nm y Bradford. La determinación de proteínas con el método de Lowry tiene varias ventajas: es un ensayo 10 a 20 veces más sensible que la medición de la absorción ultravioleta de las proteínas (280 nm), es varias veces más sensible que la detección con ninhidrina y 100 veces más sensible que la reacción de Biuret. 5. De acuerdo con tus resultados, ¿cuál es el intervalo en el que se podría determinar la concentración de una proteína en una muestra utilizando la curva estándar de determinación de proteínas por Lowry? Da una explicación. De 0.1 a 0.8 A750mn ya que al linealizar los datos estos son los límites para que el resultado sea confiable. 6. ¿Cuáles son las aplicaciones de una curva de calibración o estándar? Determinar la concentración de una sustancia (analito) en una muestra desconocida, sobre todo en disoluciones. Conclusiones ●

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Mediante una curva de calibración con BSA se determinó la concentración de proteínas en una muestra problema siendo 0.218 μg/μL para el tubo 9 y 0.374 μg/μL para el tubo 10. A medida que la proteína se encuentre en mayor proporción en una muestra, habrá más aminoácidos reaccionantes que absorban la luz incidida sobre ellos.

Referencias 1- dsflab. Albúmina sérica bovina. Argentina: dsflab [citado el 2 de febrero, 2019]. Disponible en: https://www.dsflab.com.ar/albumina-bovina 2-curiosoando.com ¿Qué es una curva de calibración? Curiosoando. [actualizando el 17 de octubre, 2016, citado el 2 de febrero, 2019]. Disponible en: https://curiosoando.com/que-es-una-curva-de-calibracion 3-elespectrofotometro.com. Espectrofotometría. El espectrofotometro. 2016.[citado el 2 de febrero de 2019]. https://elespectrofotometro.com/espectrofotometria/ 4- Valoración de proteínas por el método de Lowry. [citado el 4 de febrero, 2019]. Disponible en: h  ttp://www3.uah.es/bioquimica/Sancho/farmacia/practicas/Lowry.pdf 5- Labome.es. Cuantificación de proteínas. Labome. [actualizado el 26 de mayo, 2018, citado el 4 de febrero, 2019]. Disponible en: http://www.labome.es/method/Protein-Quantitation.html 6- Planificación de un experimento. [citado el 4 de febrero,2019]. Disponible en: http://dm.udc.es/asignaturas/estadistica2/sec2_3.html

7- Metodología de la investigación. Variables. Jacqueline Wigodski. [actualizado 10 de julio, 2010, citado el 4 de febrero,2019]. Disponible en: http://metodologiaeninvestigacion.blogspot.com/2010/07/variables.html 8- Metodología de la investigación. Las variables. Venezuela. Hernández Nairobis, Reyes Adela y Velasquez Betty. [actualizado el 12 de mayo, 2013, citado el 4 de febrero, 2019]. Disponible en: http://adelajesus.blogspot.com/ 9- Biblioteca Universitaria. Universidad de Málaga. Biblioteca de la Facultad de Medicina. [actualizado el 5 de abril, 2013, citado el 4 de febrero, 2019]. Disponible en: http://www.sld.cu/galerias/pdf/sitios/histologia/normas-vancouver-buma-2013-guia-breve.pdf 10-Ahmed,Hafiz. Principles and reactions of Protein extraction, purification and characterization. EUA.Editorial CRC Press .2  004. 11-Walker, J.M. The Protein Protocols Handbook.EUA.  Editorial Humana Press.2002....