Seminario tecnicas de separación de proteinas PDF

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Apuntes del seminario de tecnicas de separaciñon de proteinas. I Medicina UMA...

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Seminario: Técnicas para la investigación en proteínas y proteoma

Las proteínas desempeñan un papel crucial en casi todos los procesos biológicos: catálisis, transducción de señales y soportes estructurales. Esto se debe a la existencia de miles de proteínas, con una estructura específica, que le permite interactuar con una o con un conjunto de moléculas.

Así la bioquímica va a estudiar distintos aspectos de las proteínas: * Las secuencias de aminoácidos, que dan lugar a la conformación y posterior función. * Las uniones de las proteínas a los sustratos específicos y a otras moléculas.

Reacción de comprobación después de la obtención de una enzima

Un primer paso para saber como es una proteína es su purificación.

Para ello se seleccionará un ensayo y una fuente adecuada para la extracción de dicha proteína.

Se realizará un homogenado y una posterior centrifugación diferencial para obtener la mayor concentración de nuestra proteína

Selección de la muestra biológica (fuente)

MÉTODOS PARA REALIZAR LA LISIS CELULAR Algunos ejemplos son: 1. Lisis celular Válido para células sin pared celular como las células de tejidos animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias.

2. Destrucción mecánica Congelación-descongelación, prensa de French, sonicación, macerado con N2 líquido

3. Lisis con detergentes

Una vez que la proteína se ha extraído de su entorno natural está expuesta a muchos agentes que pueden dañarla. Para que ésta no se degrade se hace lo siguiente: UTILIZAR: Soluciones amortiguadoras Inhibidores de proteasas Bajas temperaturas (4°C) EVITAR Altas temperaturas Manipular demasiado la muestra PROCURAR que el proceso sea lo más corto posible.

El resultado de la lisis celular es un lisado u homogenado que contiene una mezcla de proteínas, membranas y células rotas.

Esta preparación se somete a filtración y/o centrifugación para obtener el sobrenadante

La centrifugación aprovecha las propiedades de tamaño, forma y densidad de las proteínas para separarlas de otras moléculas que presentan características distintas.

Como resultado, el efecto de la gravedad para cada proteína es diferente.

En principio, se pueden separar organelos de una solución homogénea de partículas, al exponer a la muestra a diferente fuerza gravitatoria.

VARIOS PASOS SECUENCIALES DE CENTRIFUGACIÓN A DIFERENTES VELOCIDADES

La centrifugación diferencial se basa en la existencia de diferentes partículas en la suspensión que difieren en su densidad de la del medio.

Las proteínas se pueden purificar dependiendo de sus características: o Solubilidad: Precipitación Salina o Tamaño o Carga o Afinidad específica de unión

o Diálisis

Separa las proteínas de otras moléculas como sales utilizando una membrana semipermeable.

o Cromatografía de filtración en gel

Cromatografía de intercambio iónico

Cromatografía de afinidad

Cromatografía líquida de alta presión (HPLC) Utiliza material más fino y altas presiones. Alta resolución y rápida separación.

Electroforesis en gel de acrilamida  Formación del gel por unión de acrilamida y bis-acrilamida

Se realiza en condiciones desnaturalizantes SDS: Se une a la cadena principal a razón de un anión de SDS por cada 2 residuos de un Aa Así se confiere una gran carga negativa que es proporcional a la masa de la proteína También se utiliza bmercaptoetanol para reducir los puentes disulfuro

Electroforesis en gel de acrilamida

Isoelectroenfoque Nos permite distinguir proteínas que difieren en sus pI tan poco como 0,01, es decir que se pueden separar proteínas que difieren en una sola carga neta

Electroforesis bidimensional Es la combinación de isoelectroenfoque y SDSpoliacrilamida

Los resultados de una purificación se resumen en: *Proteína total *Actividad total *Actividad específica *Rendimiento *Grado de purificación

Ultracentrifugación Nos sirve para separar componentes celulares, además de separar y analizar las propias biomoléculas. Con esta técnica determinamos la masa y la densidad. En esta técnica tenemos en cuenta los coeficientes de sedimentación

Coeficiente de sedimentación: Cuanto menor sea el valor de S, la molécula se moverá más lentamente por la fuerza centrífuga. Ultracentrifugación zonal

Determinación de la secuencia de aminoácidos: • Hidrolización del péptido • Separación de los aminoácidos por intercambio iónico • Cuantificación con ninhidrina. Todos los aminoácidos dan color azúl menos la prolina que da color amarillo. • La concentración de una Aa en disolución, tras su calentamiento con ninhidrina, es proporcional a la absobancia óptica de la disolución. Se puede detectar un microgramo de Aa • Si utilizamos fluorescamina podemos detectar un nanogramo.

Secuencia de aminoácidos

Degradación de Edman Separa secuencialmente del extremo amino terminal un residuo tras otro.

Fragmentación de una proteína

Para la secuenciación los péptidos no deben ser mayores de 50 Aas. Así, una proteína se debe fragmentar para un mejor estudio. Esta fragmentación se puede realizar por medios químicos o enzimáticos.

Dentro de los químicos nos encontramos el bromuro de cianógeno. Corta en el lado carboxílico de la metionina.

Dentro de los enzimáticos nos encontramos la tripsina. Corta en el lado carboxílico de arginina y lisina.

Conocemos la secuencia por solapamiento de bases

Si presenta puentes disulfuro hay que reducirlos

Posteriomente se aplica una electroforesis en diagonal para saber en lugar se forman estos puentes

La secuencia de Aas nos da información sobre su función, estructura e historia: *Comparar secuencias y ver si pertenece a una familia determinada. *Comparar secuencias de una misma proteína entre diferentes especies nos da información de la evolución. *Buscar repeticiones internas nos da idea de la historia de una proteína. *Hay proteínas que contienen secuencias de Aas que sirven de señales que os indican su destino o controlar su maduración *Formación de anticuerpos para una proteína específica. *Formación de sondas específicas de ADN para los genes que codifican las correspondientes proteínas.

Terapia Génica: Técnicas

Determinación de la secuencia de ADN a partir de la secuencia de Aas

Estructura de un anticuerpo y su interacción con el antígeno

ELISA: enzyme-inked immuno-absorben assay

Western blot

Síntesis de péptidos

*Los péptidos sintéticos pueden servir como antígenos para estimular la formación de anticuerpos específicos. *Los péptidos sintéticos se pueden usar para aislar receptores de muchas hormonas y otras moléculas señal. *Los péptidos sintéticos pueden utilizarse como fármacos. *Conocer mejor las estructuras tridimensionales de las proteínas a través de estos péptidos.

Activación y síntesis de péptidos

Etapas: Método en fase sólida 1. Anclaje del aminoácido Cterminal 2. Desprotección del amino terminal 3. Acoplamiento del siguiente residuo 4. Liberación del péptido terminado

Espectrofotometría de masas La espectrometría de masas es una técnica analítica de gran potencial que nos permite elucidar estructuras químicas, se basa en la medición de la relación masa/carga de especies moleculares. Las determinaciones requieren de la generación de especies cargadas eléctricamente, lo cual se logra por diferentes metodologías como pueden ser el impacto electrónico, el bombardeo de átomos rápidos (FAB), el análisis directo en tiempo real (DART) y la generación de iones enlazados. La medición de la relación masa/carga nos permite también saber el peso molecular exacto de la molécula.

La detección de la estructura tridimensional de las proteínas se realiza a través de:

*Cristalografía de Rayos X. *Espectroscopía de resonancia magnética. Además la estructura nos revela la dinámica de la proteínas en disolución.

Problemas durante la purificación: Bajo rendimiento, poca solubilidad, inactivación de la enzima, agregados, adsorción a la matriz, contaminación, presencia de la enzima en varias fracciones, proteólisis.

Gracias por vuestra atención...