3.4 Tecnicas de hibridacion PDF

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Apuntes sobre tecnicas de hibridación, fundamentos y usos...

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3.2 Técnicas de hibridación – Sondas Para avanzar hacia un estudio más detallado del ADN fue necesaria una metodología que permitiera obtener grandes cantidades de fragmentos específicos de ADN. Estos fragmentos podían ser ADN genómico, ADN complementario (ADNc) o ADN obtenidos a partir de oligonucleótidos sintéticos. A menudo, antes de que un determinado fragmento de ADN o de ARN mensajero (ARNm) pueda manipularse de cualquier modo, primero debe localizarse. Para localizar fragmentos específicos se utiliza la técnica de hibridación de ácidos nucleicos. Entre las técnicas de hibridación más comunes se encuentran Southern blot, Northern blot, Slot blot, Dot blot e hibridación in situ. Sondas Las sondas son segmentos de ADN o ARN de cadena sencilla marcados con moléculas reporteras, como enzimas o radioisótopos, que permiten su fácil detección. El diseño de la sonda, es decir, su secuencia nucleotídica, es lo que le permitirá, entre miles de fragmentos que forman parte del genoma de un ser humano, identificar “un solo gen” o “el fragmento de un gen”. La longitud de las sondas puede ir de 15 a 30 bases, conocidas también como oligonucleótidos, hasta miles de bases de nucleótidos. En términos generales las sondas se obtienen a partir de síntesis química o de plásmidos, que se clonan con la sonda de interés. Southern blot Es una estrategia estándar para analizar ADN previamente digerido con enzimas de restricción. Esta técnica se utiliza para determinar la presencia de un gen o fragmentos del ADN específicos en una mezcla de ácidos nucleicos previamente extraídos. Se basa en la aplicación de dos procesos fundamentales: la desnaturalización o separación de las cadenas complementarias del ADN y la hibridación o unión de dos cadenas complementarias. Procedimiento 1) Primero se aísla el ADN de cualquier célula del organismo (excepto de glóbulos rojos, ya que carecen de núcleo). 2) Una vez extraído el ADN, se digiere con enzimas de restricción y los fragmentos se separan por electroforesis en geles de agarosa.

* Las moléculas de ADN separadas pueden visualizarse mediante su tinción con bromuro de etidio. 3) Posteriormente, el ADN se desnaturaliza para obtener cadenas sencillas, mediante un proceso químico, generalmente por tratamiento con álcalis. 4) A continuación, los fragmentos se transfieren del gel a un soporte sólido, como membranas de nitrocelulosa o de nailon. > Es importante señalar que la finalidad de la transferencia es crear una réplica de lo que se tenía en el gel, ahora en un soporte mucho más sólido, como es una membrana < 5) Por último, para identificar uno o más fragmentos entre millones de fragmentos, se utiliza una sonda específica marcada con alguna molécula reportera. 6) La sonda se pone en contacto con la membrana de nitrocelulosa y en aquellos lugares en donde la sonda encuentre su secuencia complementaria se pegará, proceso conocido como hibridación. 7) La sonda emitirá radiactividad, la cual se detectará mediante un proceso de revelado con placas de rayos X, la emisión de la sonda corresponderá únicamente al fragmento de interés. Marcaje de las sondas Las sondas pueden marcarse radiactivamente (en general con 32P) o enzimáticamente (biotina, digoxigenina, etc.). Una ventaja de los sistemas enzimáticos es que, una vez marcada la sonda, su vida media es muy larga (meses), mientras que el marcaje radiactivo es más corto (para 32P  15 días). Las radiactivas detectan hasta 0.1 pg., de ácido nucleico y las enzimáticas, entre 1 y 10 pg.  Las sondas pueden marcarse en un extremo o a lo largo de toda la cadena El marcaje en toda la sonda se realiza por el procedimiento de nick traslation. En este método se combinan dos actividades enzimáticas: 1. Actividad ADNsa 1, que suprime un nucleótido al azar de una de las dos cadenas de la sonda. 2. Actividad de ADN polimerasa, que, a partir del hueco dejado en la cadena de ADN por la ADNsa 1, va incorporando nuevos nucleótidos por complementariedad (entre los que están marcados), tomando como molde la otra cadena de ADN intacta.

Otro método para marcar sondas es el de random primers: secuencias cortas de oligonucleótidos (normalmente hexámeros), que por su pequeño tamaño hibridan al azar a lo largo de toda la cadena. Al añadir la enzima ADN polimerasa 1 desde el lugar donde se unen los primers, van incorporándose nucleótidos en donde algunos van marcados radiactivamente hasta que finalmente se completa la cadena. Aplicaciones de Southern blot La técnica de Southern blot ha sido de gran utilidad para identificar genes asociados con enfermedades de transmisión genética, e identificar mutaciones, como “rearreglos”, deleciones y dosis génica en caso de portadores. También se utiliza para detectar polimorfismos en los fragmentos de restricción de diversos genes. Northern blot Es la contraparte del Southern blot y como ácido nucleico se utiliza ARN en lugar de ADN. A diferencia del Southern blot, con esta técnica no se utilizan enzimas de restricción, ya que las moléculas de ARN son más pequeñas y para su análisis no requieren su fraccionamiento. Sin embargo, prácticamente comparten todos los demás pasos, como son la electroforesis, la desnaturalización (aunque el ARN es de cadena sencilla, puede formar estructuras secundarias), la transferencia y la hibridación con una sonda. Aplicaciones de Northern blot Es una herramienta muy útil para el estudio de los productos de la transcripción génica (ARNm) y de su regulación, ya que se pueden estudiar las potenciales variaciones en la abundancia de especies del ARN en diferentes condiciones experimentales o comparar condiciones clínicas normales o patológicas. Dot/slot blot Tras el aislamiento y separación de los ácidos nucleicos, éstos se aplican directamente a la membrana sin separarlos, según su peso molecular; es decir, no se realiza electroforesis. La fijación se hace generalmente con vacío y en un molde cuyo pocillo puede tener forma de punto (dot blot) o ser lineal (slot blot).

Es posible realizar detecciones no sólo cualitativas (positivo o negativo) sino también cuantitativas, utilizando como patrón diluciones seriadas de concentraciones conocidas del genoma que se está determinando. Hibridación in situ Es un método histoquímico que emplea a la biología molecular de la misma manera que la inmunohistoquímica utiliza los métodos de inmunología. Los principios de ambos métodos son semejantes y el resultado final es el mismo: la identificación de componentes tisulares que pueden observarse al microscopio. La especificidad de la inmunohistoquímica se basa en la unión antígeno/anticuerpo, mientras que la especificidad de la hibridación in situ se basa en la unión de una sonda con una secuencia complementaria de ADN o ARN dentro de un tejido. A diferencia de Southern blot y Northern blot, la hibridación in situ no requiere de la extracción de ácidos nucleicos, sino que en el mismo tejido se lleva a cabo el procedimiento de detección e hibridación; de ahí el nombre de in situ (en el mismo lugar). Las sondas que se utilizan para la hibridación in situ pueden ser radiactivas y no radiactivas. En la actualidad, las más relevantes son las marcadas con fluorescencia, modalidad conocida como hibridación in situ acoplada a un sistema de fluorocromos (FISH), o con biotina. Aplicaciones de Hibridación in situ Permite la localización de secuencias génicas a nivel cromosómico, con lo que se pueden detectar translocaciones y otras alteraciones cromosómicas, así como el estudio de expresión de genes (ARNm) a nivel celular y subcelular. Las principales aplicaciones son la identificación de infecciones virales en tejidos, así como el mapeo cromosómico....