TD+Correction CP2016 Chromato-up by Bilak PDF

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MASTER – CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE CORRIGE Exercice N° 1 : Le chromatogramme 1 a été obtenu dans les conditions suivantes : Colonne : longueur : L = 15 cm - diamètre interne: d = 0,5 cm Vitesse de défilement du papier : v = 2 cm/min Phase stationnaire : Silice greffée C18 Phase mobile : Eau/Méthanol (50/50) Débit : D = 0,6 mL/min Le composé A est un composé non retenu sur la colonne utilisée. A partir de ce chromatogramme déterminer : 1) L'efficacité pour les deux composés B et C 2) L'efficacité moyenne de la colonne 3) Le volume mort Vm de la colonne 4) Le volume de la phase stationnaire VS 5) Les facteurs de rétention kB et kC des deux composés B et C. 6) Les constantes d'équilibre de partition KB et KC des deux composés B et C. 7) La sélectivité de la séparation. 8) La résolution R de la séparation. 9) La résolution de Purnel RP de la séparation. Un aggrandissement de la zone des pics B et C est fourni pour faciliter les mesures.

NB = (3,90/0,04043)2 = 9305 NC = (4,38/0,04753)2 = 8492 Nmoyen = 8899 VM = D * tM = 0,6 * 0,95 = 0,57 mL Vint = L * * d2 / 4 = 15 * * 0,52 / 4 = 2,945 mL VS = Vint – VM = 2,375 mL kB = ( tB – tM ) / tM = ( 3,90 – 0,95 ) / 0,95 = 3,105 kC = ( tC – tM ) / tM = ( 4,38 – 0,95 ) / 0,95 = 3,611 KB = kB VM / VS = 3,105 * 0,57 / 2,375 = 0,745 KC = kC VM / VS = 3,611 * 0,57 / 2,375 = 0,866 = KC / KB = kC / kB = 1,16 R = ½ * ( tC – tB) / ( B + C) = ½ * ( 4,38 – 3,90 ) / ( 0,04043 + 0,04753 ) = 2,73 R = ½ N1/2 ( tC – tB) / ( tC + tB) = ½ * 88991/2 * ( 4,38 – 3,90 ) / ( 4,38 + 3,90 ) = 2,73 R = 2,73 RP = ¼ * N1/2 * [ (1 - ) / ] * [ kC / (1 + kC ) ] = ¼ * 88991/2 * [ 0,16 / 1,16 ] * [ 3,611 / 4,611 ] RP = 2,55

Exercice 2 : Influence du débit sur l'efficacité d'une colonne – Courbe de Van Deemter/Knox Rappel : L'équation de Van Deemter/Knox est de la forme h(u) = A0 + B0/u + C0*u u est la vitesse moyenne d'écoulement de l'éluant. On peut écrire une équation de la même forme en utilisant le débit au lieu de la vitesse. h(D) = A + B/D + C*D

Myers et Weigand (Alltech) ont étudié la séparation de deux composés sur deux colonnes différentes ainsi que l'influence du débit. Leurs résultats expérimentaux sont fournis. Le tableau suivant donne les valeurs de l'efficacité N en fonction du débit pour le Kaempférol sur deux colonnes différentes. Longueur (cm)

Diamètre (cm)

Diamètre des particules de phase stationnaire ( m)

Colonne 1 15

0,46

5

Colonne 2 10

0,46

3

Débit (mL/min)

0,2

0,5

0,7

1

1,4

1,7

2

N colonne 1

10282

13355

13147

12269

11229

10202

9565

N colonne 2

12481

20278

21489

22662

21197

20190

19524

1) Etablir la relation entre débit et vitesse moyenne d'écoulement. D = VM / tM u = L / tM u = L * D / VM 2) Etablir les expressions des paramètres de Knox pour le débit A, B et C en fonction des paramètres de Knox pour la vitesse A0, B0 et C0 et de caractéristiques physiques de la colonne dont on précisera la nature. h(u) = A0 + B0 / u + C0 * u h(u) = A0 + B0 / ( L * D / VM ) + C0 * L * D / VM h(u) = A0 + B0 VM / ( L * D ) + C0 * L * D / VM h(D) = A + B/D + C*D A = A0 B = B0 VM / L C = C0 * L / VM

3) Déduire des résultats expérimentaux le débit optimal d'utilisation des deux colonnes. 4) Déterminer les valeurs de A, B et C pour les deux colonnes. a) par la méthode vue en cours b) Tracer sur un même graphique les courbes h = f(D) expérimentale et théorique en utilisant les valeurs de A, B et C trouvées. Conclusion ? c) Pour améliorer la détermination expérimentale de A, B et C il est ici préférable de résoudre le système d'équations pour trois points expérimentaux. On prendra les deux débit extrèmes et le débit optimal. On écrira les trois équation à résoudre pour déterminer A, B et C. Le système sera ensuite résolu par utilisation d'une calculatrice fournie. L'enseignant vous indiquera la procédure à suivre. Colonne 1 D 0,2 0,5 0,7 1 1,4 1,7 2

h1 = 15 / N1 0,00145886 0,00112317 0,00114094 0,00122259 0,00133583 0,0014703 0,00156822

D1 opt A1 C1 B1 = C1 * D1opt^2

h1 reg

0,0014703 0,00156822

0,6 0,0009 0,0003 0,000108

A1 calc C1 calc B2 calc

h1 theo 0,0015 0,001266 0,00126429 0,001308 0,00139714 0,00147353 0,001554

h1 calc 0,0014578 0,001123 0,001124086 0,001193 0,001329743 0,001446153 0,0015685

5,82E-04 4,54E-04 1,57E-04

Colonne 2 D 0,2 0,5 0,7 1 1,4 1,7 2

h2 = 10/N2 0,00077876 0,00049315 0,00046535 0,00044127 0,00047176 0,00049529 0,00051219

D2 opt A2 C2 B2 = C2 * D2opt^2

h2 theo 7,12E-04 5,50E-04 5,28E-04 5,20E-04 5,27E-04 0,00049529 5,37E-04 0,00051219 5,50E-04

1 0,0004 6,00E-05 0,00006

h2 reg

A2 calc C2 calc B2 calc

h2 calc 8,04E-04 4,94E-04 4,53E-04 4,42E-04 4,60E-04 4,84E-04 5,12E-04

1,98E-04 1,28E-04 1,16E-04

La détermination de A, B et C se fait en supposant que pour les haut débits le terme B/D devient négligeable devant A + B * D et qu'on a donc alors h = A + C * D. La détermination de A et C est alors directe : A = ordonnée à l'origine et C=pente de la droite. La détermination de B se fait en utilisant le débit optimal d'utilisation estimé graphiquement, il correspond au mimimum de la courbe h = d(D). Ce minimum est observé quand la dérivée s'annule soit : 0 = C – B / D2 D = (B / C )1/2. Pour que cette méthode donne de bons résultats il faut que les points utilisés correspondent réellement à des débits élevés, ici cette méthode est assez peu satisfaisante et l'accord entre courbe expérimentale et courbe théorique n'est pas excellent. Cela vient du fait que les expériences faites n'incluent pas des débits suffisament élevés pour que l'approximayion soit valable. La forme de la courbe est toutefois très correcte. Pour améliorer il faut résoudre le système de trois équations à trois inconnues. h1 = A + B / D1 + C * D1 h2 = A + B / D2 + C * D2 h3 = A + B / D3 + C * D3 La résolution conduit à des valeurs da Acalc, Bcalc et Ccalc bien meilleures et l'accord entre valeurs calculées et expérimentales est alors très correct. (Voir les courbes obtenues). Remarque : Les calculs ont été effectués en utilisant le débit en cm 3/min et la hauteur équivalente h en cm, dans ces conditions les unités da A, B et C sont : A en cm , B en cm4.min-1 et C en min.cm-2 En supposant que les colonnes utilisées suivent bien la loi empirique reliant la vitesse optimale uopt au diamètre dp des particules de phase stationnaire : uopt = 0,5/dp 5) Déterminer les volumes morts des deux colonnes. La valeur du débit optimal est connue,.on peut soit l'estimer graphiquement soit la calculer par Dopt = (B/C)1/2 en utilisant les valeurs de Bcalc et Ccalc déterminées précedemment. La valeur de la vitesse optimale est déterminée par la formule empirique :uopt = 0,5/dp avec pour les unités utilisées : u en cm/s ; L en cm et dp en m. La relation u = L * D / VM permet ensuite de déterminer VM. VM = L * D / u Il faudra exprimer le débit en cm3/s (ou u en cm/min) pour avoir des unités cohérentes. Dopt graphique

Dopt calculé

Dopt

uopt

VM

Vint

Colonne 1

0,6 mL/min

0,59 mL/min

0,01 mL/s

0,1 cm/s

1,5 mL

2,49 mL 0,602

Colonne 2

1 mL/min

0,95 mL/min

0,0167 mL/s 0,167 cm/s

1 mL

1,66 mL

0,602

Remarque : Puisque l'écart entre la détermination graphique et la valeur calculée pour Dopt est très faible nous retiendrons la valeur déterminée graphiquement pour le calcul de VM. Le fait de trouver une porosité identique pour les deux colonnes semble montrer que l'hypothèse est correcte.

6) Déterminer les facteurs de rétention k1 et k2 des deux composés. 7) Déterminer la sélectivité

et la résolution R de la séparation pour les deux colonnes.

Le débit étant de 1 mL/min, le temps mort (en minutes) et le volume mort (en mL) s'expriment par le même nombre. Les temps de rétentions sont mesurables sur les chromatogrammes. La résolution R peut s'exprimer par R = ½ * ( t1 – t2 ) / ( 1+ 2 ) Toutefois la détermination de 1 et 2 est très hasardeuse sur les chromatogrammes fournis, l'échelle étant très petite. Il est plus aisé d'utiliser l'efficacité pour le composé 2 qui a été déterminée précedemment pour le débit considéré. On supposera que les efficacités sont identiques pour les deux composés. On peut alors utiliser la relation R = ½ N1/2 (t2 - t1) / ( t1+ t2 ) On peut également calculer R par la relation de Purnel. Colonne 1 : 10 min = 5,65 cm t1 = 4,45 cm = 7,89 min k1 = ( 7,89 – 1,5 ) / 1,5 = 4,26 t2 = 4,80 cm = 8,49 min k2 = ( 8,49 – 1,5 ) / 1,5 = 4,66 = k2 / k1 = 4,66 / 4,29 = 1,1 R = ½ * 122691/2 * ( 8,49 – 7,89 ) / ( 8,49 + 7,89 ) = 2,03 RP = ¼ * N1/2 * ( – 1 ) / * k2 / ( 1+ k2 ) RP = ¼ * 122691/2 * 0,1 / 1,1 * 4,59 / 5,59 = 2,07 Colonne 2 : 10 min = 5,8 cm t1 = 2,85 cm = 4,91 min k1 = ( 4,91 – 1 ) / 1 = 3,91 t2 = 3,25 cm = 5,60 min k2 = ( 5,60 – 1 ) / 1 = 4,60 = k2 / k1 = 4,60 / 4,91 = 1,18 R = ½ * 226621/2 * ( 5,60 – 4,91 ) / ( 5,60 + 4,91 ) = 4,93 RP = ¼ * N1/2 * ( – 1 ) / * k2 / ( 1+ k2 ) RP = ¼ * 226621/2 * 0,18 / 1,18 * 4,6 / 5,6 = 4,72 8) Conclure sur l'intérêt comparé des deux colonnes, d'un point de vue pratique et économique. On voit qu'il est très interressant d'utiliser une colonne plus courte avec un diamètre des particules plus petit (colonne 2). La résolution est nettement supérieure avec des temps d'analyse et donc une consommation d'éluant bien moindre. L'efficacité de la colonne augmente sensiblement quand la taille des particules diminue, cela permet de diminuer sa longueur sans perte d'efficacité. Le modèle simple vu en cours permet de bien le comprendre. hopt est sensiblement proportionnelle à dp : hopt = k dp h est inversement proportionnelle à N : h = L / N Donc N = h / L = k dp / L Si on divise dp par deux on peut également diviser L par deux tout en gardant la même efficacité en se plaçant au débit optimal d'utilisation de la colonne.

Le débit optimal d'utilisation est lui même inversement proportionnel à dp : uopt = 0,5 / dp La colonne 1 contenant des particules plus grosses a un débit optimal d'utilisation plus faible (0,6 mL/min), et la colonne 2 un débit optimal plus élevé (1 mL/min). En se placant à un débit de 1 mL/min on est donc au maximum d'efficacité de la colonne 2, alors que la colonne 1 est alors nettement moins efficace bien que de longueur plus élevée. Normalement les facteurs de rétention k1 et k2 et donc devraient rester sensiblement constants entre les deux colonnes puisque on garde la même nature pour les phases stationnaires et mobiles et également la même température. C'est approximativement ce qui est observé, les valeurs de k1 et k2 ne diffèrent que de 1% entre les deux colonnes. La résolution dépend alors seulement de N (k et identiques) et elle est beaucoup plus élevée pour la colonne 2. Le rapport des résolutions 4,09/2,06 = 1,98 est bien sensiblement égal au rapport des efficacités 22662/12269 = 1,85. 9) On constate que les pics sont plus hauts pour la colonne 2. Pour quelle raison ? Cela at-il un intérêt pratique ? La hauteur des pics est inversement proportionnelle à leur écart type. Plus l'efficacité sera grande et plus la hauteur des pics sera élevée. Cela permetra de détecter plus facilement des composés présents en toute petite quantité, la sensibilité sera plus élevée si l'efficacité est plus importante. Il est donc interressant d'utiliser la colonne 2 pour améliorer la sensibilité de l'analyse. Enfin la finesse des particules augmente la pression à utiliser mais cela est compensé par la longueur moindre de la colonne. Il n'y a donc finalement que des avantages à utiliser la colonne 2.

Exercice 3 : Application analytique Exploiter les chromatogrammes suivants pour déterminer les concentrations des composés A et B dans l'échantillon.

ETALON A B (étalon interne) C

t 3,26 4,52 5,23

Cetalon 0,25 0,35 0,45

Setalon 37500 70000 67500

Si/Set 0,536 1,000 0,964

k 2,143 2,857 2,143

Si/Set 0,402 1,000 0,627

k 2,143 2,857 2,143

Céchantillon 0,188 0,350 0,293

ECHANTILLON

A B (étalon interne) C

t 3,28 4,54 5,25

Sechantillon 22500 56000 35100

Soit pour les concentrations cherchées : A : 0,188 g.L-1 B : 0,293 g.L-1 Remarque : La méthode de l'étalon interne était indispensable car les surfaces des pics de B sopnt sensiblement différentes dans les deux chromatogrammes ce qui montre qu'il y a eu une erreur d'injection non négligeable....