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Capítulo 2 C OMPO SIC IÓN, ES TRUC T URA Y PROPI EDA DES DE L OS Á C IDOS NUC L E IC OS

1. ADN 1.1. Componentes del ADN En 1920, Levene además de acuñar el término nucleótido descubrió cuáles eran los componentes de los ácidos nucleicos: fosfato + azúcar + base nitrogenada.

Figura 1.

AZÚCARES Levene también descubrió que los azúcares que constituían al ARN y ADN eran distintos. En el ARN nos encontramos la ribosa y en el ADN nos encontramos a la desoxirribosa. La ribosa del ARN presenta un grupo OH en el carbono 2, lo que hace que la molécula sea más reactiva y por consecuencia más inestable que el ADN. Esta inestabilidad impide la formación de dobles hélices estables.

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Rocío Prieto Vázquez

Los carbonos que priman para la unión de un azúcar de un nucleótido con otro son los carbonos 5 y 3.

Figura 2.

BASES NITROGENADAS Las bases nitrogenadas son compuestos orgánicos heterocíclicos aromáticos, con dos o más átomos de nitrógeno. Hay dos tipos: • Purinas: consiste en un anillo de pirimidina fusionado a un anillo de imidazol. Las purinas son el heterociclo que contiene el nitrógeno más extendido en la naturaleza. Dentro de las purinas tenemos a la adenina y guanina. • Pirimidinas: las primidinas son una diazina, uno de los seis miembros del compuesto heterocíclico aromático orgánico, con dos átomos de nitrógeno en las posiciones 1 y 3. Dentro de ellas tenemos a la citosina, la timina y el uracilo.

Figura 3.

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Figura 4. Purinas.

Rocío Prieto Vázquez

Figura 5. Pirimidinas.

El nombre de la purina o la pirimidina muda si se combina con el azúcar: adenina

adenosina

citosina

citidina

guanina

guanosina

uracilo

uridina

timina

timidina

ENLACE FOSFODIÉSTER El enlace fosfodiéster conecta un grupo fosfato al carbono 5 de una pentosa de un nucleótido al carbono 3 de una pentosa del nucleótido adyacente. Son enlaces covalentes muy fuertes.

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Figura 6.

NUCLEÓTIDOS Un nucleótido está constituido por la unión covalente de un monosacárido de cinco carbonos (pentosa), una base nitrogenada y más un grupo fosfato. Un ejemplo de nucleótido es el ATP.

Figura 7.

Por otro lado, está el término nucleósido que no es más que la parte del nucleótido formada solo por la base nitrogenada y la pentosa.

Figura 8.

Es decir, el paso a decir entre nucleótido a nucleósido está en sí hay la presencia del azúcar o no.

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1.2. Modelo de la estructura del ADN El trabajo de Watson & Crick en 1953 supuso el nacimiento de la biología molecular y genética moderna. La publicación de su modelo tendría una importancia funcional, pues, por ejemplo, nos puede mostrar su replicación. Más adelante se postularía el modelo de replicación. Por su modelo de la doble hélice del ADN, Watson & Crick recibieron el premio nobel en 1962.

ANTECEDENTES: PROPORCIÓN DE BASES (REGLA DE CHARGAFF) En 1949, Chargaff se dispuso a estudiar la composición química del material hereditario partiendo de ADN de diferentes seres vivos. Al final de sus estudios se concluyó en lo que se denomina regla de equivalencia de bases. Analizó, en una primera instancia, su composición de bases (porcentaje de bases). Tendríamos que suponer de aquellas que el porcentaje de bases sería 25% para cada una Figura 9. de ellas, si se cumpliese la teoría del tetranucleótido. En la actualidad sabemos que no es así. Para este análisis llevó a cabo técnicas de cromatografía. Tras realizar el experimento, deduce la concentración de A, T, C y G para cada una de las especies analizadas. Para ello se suele usar el porcentaje de G y C, sumando sus porcentajes. El primer dato que se puede observar es que los porcentajes de G y C son muy variables. El contenido de los cuatro nucleótidos a lo largo de la cadena polinucleotídica es muy variable entre las especies. Por lo tanto, se invalida la hipótesis del tetranucleótido de Levene. Esta variabilidad en el contenido de los nucleótidos explica la enorme diversidad biológica. Otra observación importante es que cuando mira la proporción entre T y A es muy próxima a 1. También encuentra que si mira los porcentajes de G y C la proporción es próxima a 1. Que no sea 1 es debido a que las cuantificaciones de nucleótidos por cromatografía en papel no eran precisas. En la actualidad con los nuevos métodos, la proporción A/T y C/G es siempre 1 (mismo contenido de A = T, C = G). Si se hace comparación entre las bases púricas (A, G) y las pirimidínicas (C, T), la relación es muy próxima a 1. No obstante, la relación (A+T) / (C+G) no es próximo a 1. Esto es lo que se denomina la regla de equivalencia de bases de Chargaff. No supo darle una explicación a esta equivalencia, pero serviría para secuenciar la estructura secundaria del ADN.

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ANTECEDENTES: ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DEL ADN (WILKINS & FRANKLIN) Para conocer cómo era la estructura de la molécula de ADN se tuvieron que hacer varios estudios. Una de las claves fue la técnica de la estructura tridimensional del ADN mediante difracción de rayos X sobre fibras. Se parte de fibras de ADN. Para obtener esas fibras partimos de una solución con ADN con un alto contenido de agua. Con una pipeta Pasteur, se introduce en la sustancia viscosa y de ahí salen hilos que son las fibras de ADN. Estas fibras están orientadas en paralelo y tienen cierta rigidez. También debemos tener muy constante la humedad relativa (92%), que es fundamental en la estructura secundaria del ADN. Estas fibras de ADN las ponemos en una trayectoria de un haz de rayos X (los suministra una lámpara de rayos X). Entonces, el patrón de rayos difractantes se recogen en una película fotográfica sensible a los rayos X. Esta fotografía se imprime y obtenemos la imagen de la molécula. Esta imagen da bastante información porque el ADN presenta huecos que se encuentran también en la imagen. Observamos una especie de bandas o spots que nos da idea de la estructura secundaria del ADN.

Figura 10.

Este análisis de difracción nos proporciona información sobre características generales del ADN (diámetro, número de pares de bases, distancia internucleotídica, …), pero tiene limitaciones. Al estar en una solución acuosa, los enlaces químicos que unen los átomos no están fijos, pueden rotar. Esto lo que genera es un cierto grado de incertidumbre, porque diferentes modelos sobres la estructura secundaria son compatibles con los datos analizados. Un investigador llamado Wilkins pudo conseguir tras varios experimentos un ADN muy puro. Si el ADN es puro nos va a dar una información más nítida. Analizó las imágenes de difracción por rayos X. Extrajo ADN y lo cristalizó para ello. Descubrió que el ADN cuando se le extrae agua

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forma cristales. Esto quiere decir que las moléculas de ADN son uniformes y si son así es una evidencia de que tiene una única estructura secundaria. Si hubiera muchas estructuras no formaría cristales. Tras todo esto, la cuestión que se abordó fue si estaban ante una estructura o si estaban entre varias. R. Franklin fue máxima experta en difracción de rayos X. Obtuvo una foto que se considera una de las más grandes de la ciencia llamada Foto 51, clave para deducir como es la estructura del ADN. En esa foto observa estructuras cruciformes. Esto le sugiere que en el ADN hay una estructura helicoidal (estructura en hélice). En definitiva, el primer modelo helicoidal de la estructura de la molécula de ADN fue propuesto por Franklin. Figura 11.

Estas hélices son debidas a los enlaces azúcar-fosfato. Postula que el diámetro del ADN es de 2 nm, que la distancia internucleotídica es 0,34 nm y que cada vuelta de hélice implica una magnitud de 3,4 nm. Cuando se analiza el diámetro que es de 2 nm y se compara con la densidad, este contraste dice que el ADN debe estar formado por más de una cadena polinucleotídica. Más adelante, Watson & Crick trabajan en la estructura secundaria de ADN, pero hubo un momento crítico para establecer su modelo y fue cuando encontraron la foto 51.

CONSTRUCCIÓN DE MODELOS MOLECULARES A ESCALA DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL ADN Watson & Crick se decantaron por una estructura de dos cadenas polinucleotídicas en forma de hélice. La pregunta que surgió tras esto fue cómo esas cadenas se asociaban. Comienzan a elaborar modelos de escala de los cuales obtienen que en todos ellos se establecieron los enlaces azúcar–fosfato en un lugar determinado, en este caso se localizaban fuera de la molécula. Las bases se encuentran hacia el interior, perpendiculares al eje de la molécula y apiladas. A estos modelos también le incorporaron los que ya se sabía cómo la distancia internucleotídica, el diámetro del ADN,… El problema surge con el emparejamiento de las bases.

Figura 12.

En un principio, Watson & Crick, recurrieron a libros de química en los cuales decían que las bases nitrogenadas adquirían formas tautoméricas. Según esto, los átomos de hidrógeno no ocupan posiciones fijas, sino que pueden desplazarse de unas posiciones a otras dando lugar a

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formas tautoméricas. Se decía que el grupo ceto (C = O) sufría variaciones en los átomos de hidrógeno y pasaba a enol (-OH); y los grupos amino (-NH2) podrían pasar a grupos imino (-NH). Entonces, las bases nitrogenadas podrían agruparse de formas muy distintas por lo que se cambiaba el apareamiento de las bases dependiendo de las formas tautoméricas. Watson & Crick decían que no podía haber esta ambigüedad, que debía ser más estable. J. Donohue dijo que, según su criterio, los libros de texto de química estaban equivocados. La forma tautomérica más frecuente son cetonas y amino. En algún que otro caso se pueden dar enoles e iminos. Por lo tanto, las dos cadenas se van a asociar de la siguiente manera: ➢ Timina y adenina por dos puentes de hidrógeno. ➢ Citosina y guanina por tres puentes de hidrógeno. De esta manera repescan la hipótesis de Chargaff en el que la concentración de timinas era igual que la de adeninas y la concentración de citosinas igual que la de guaninas. También coinciden en que las bases son complementarias.

CARACTERÍSTICAS DEL MODELO DE LA DOBLE HÉLICE ➢ Doble hélice dextrógira. ➢ El diámetro de la doble hélice es de 2,0 nm. ➢ El esqueleto azúcar-fosfato ocupa una posición exterior. ➢ Las bases nitrogenadas se disponen en el interior perpendicularmente al eje de la molécula. ➢ La base adenina se empareja con la timina mediante dos puentes de hidrógeno y la citosina con la guanina mediante tres puentes de hidrógeno. ➢ Las dos cadenas son complementarias y antiparalelas. ➢ La unidad de repetición es un mononucleótido. ➢ La distancia internucleotídica es de 0,34 nm. ➢ Cada par de bases imprime una rotación de +36 grados. ➢ La doble hélice contiene alrededor de 10 pb/vuelta, ya cada vuelta ocupa una distancia de 3,4 nm. ➢ Doble hélice con dos surcos (mayor y menor).

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Figura 13.

1.3. Propiedades: estabilidad Mientras que cada puente de hidrógeno es extremadamente débil (en comparación con el enlace covalente fosfodiéster entre ribosas), millones de puentes de hidrógeno juntos representan una fuerza extremadamente fuerte lo que mantiene a la dos cadenas de ADN juntas. La interacción G≡C es más fuerte (aproximadamente 30%) que la interacción A=T y las regiones ricas de AT son más propensas a fluctuaciones térmicas. Esto se debe a que la

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interacción GC tiene tres puentes de hidrógeno, uno más que la unión AT que tiene dos. Cuantos más puentes de hidrógeno más fuerte es la unión y se requiere de más energía para romperla. Las bases están orientadas perpendicularmente al eje de la hélice en el interior puesto que los puentes de hidrógeno son hidrofóbicos. Las fuerzas hidrofóbicas (las que surgen como antagonismo con el agua) pueden contribuir significativamente a la estabilidad de la doble cadena del ADN. Los grupo fosfato de los enlaces fosfodiéster están cargados negativamente. Esta repulsión obliga a los fosfatos a tomar lados opuestos en las hebras de ADN. Los grupo fosfato cargados negativamente son libres de interactuar con proteínas cargadas positivamente (histonas), con iones metálicos como el magnesio y con poliaminas en fuerzas electroestáticas.

Las interacciones G-C son más fuertes que las de A-T.

Los grupos fosfato de los enlaces fosfodiéster están cargados negativamente.

Las bases están orientadas perpendicularmente al eje. En esta dirección los puentes de hidrógeno son hidrofóbicos. Dan estabilidad.

Figura 14.

En definitiva, la estructura de la doble hélice es uno de los polímeros de la naturaleza más estables y rígidos debido principalmente a tres factores:

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➢ Puentes de hidrógeno ➢ Interacciones hidrofóbicas ➢ Cargas negativas en los grupos fosfato ➢ Pares de bases apilados con fuerza Sin embargo, cierta flexibilidad es requerida porque la estructura es extremadamente larga. Debe estar compactada y doblada para que pueda caber en un espacio relativamente pequeño dentro del núcleo.

1.4. Material hereditario Los requisitos para que una molécula contenga el material hereditario se describen en los siguientes puntos: ➢ Contener una información compleja ➢ Ser estable y replicarse con fidelidad. Cuando se propuso el modelo de la doble hélice aún no se sabía como se obtenían proteínas a partir de ADN. ➢ Codificar fenotipos

1.5. Variaciones de la estructura ESTRUCTURAS DE LAS BIOMOLÉCULAS

➢ Primaria: secuencia de nucleótidos ➢ Secundaria: estructura en el espacio (hélices α, láminas β) ➢ Terciaria: es la estructura secundaria plegándose sobre sí mismas (glóbulos…)

Figura 15.

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ADN-B En un primer momento se comentaba que el ADN constaba de una única estructura secundaria pues formaban cristales, cosa que no sería posible si hubiera más estructuras. Tras esto, se abordó si había o no más estructuras que la del modelo de doble hélice. Watson & Crick observaban una forma que estaba a un 92% de humedad relativa y ese era el ADN-B. No obstante, en otra humedad relativa (75%), se encontraba otra estructura secundaria distinta al cual se le denominó ADN-A. Se encontraron otras estructuras secundarias: ADN-C, ADN-D, ADN-P (en honor a Pauli). Estas nuevas estructuras se obtienen en bajas concentraciones de humedad relativa. Estas estructuras presentan las características generales del ADN-B, pero difieren en parámetros como el diámetro y el número de pares de bases por vuelta. Por ejemplo, e ADN – A tiene un diámetro de 23 Å y tiene 11 pares de bases por vuelta.

Figura 16.

La conclusión a la que se llegó era que tenía poca significación biológica porque el ADN se encuentra en altas tasas de humedad relativa, considerando entonces el ADN-B como el ADN que se encuentra en la naturaleza. Las demás estructuras se obtienen en el laboratorio bajando la humedad relativa. Las características del ADN-B ya las hemos descrito con anterioridad. Algo a destacar es que dicho ADN tiene dos surcos, que son zonas de interacción de proteínas para su regulación. Uno de los surcos es mayor (más ancho y más profundo) y otro menor (menos ancho y profundo). Si la molécula fuera plana, las moléculas que se asociaran con el ADN les sería difícil alojarse allí. Los surcos permiten que esas moléculas se asocien a estos lugares de alojamiento.

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Generalmente se asocian al surco mayor, ya que en este surco los grupos de bases están más expuestos y serían mejor reconocidas. Las secuencias de bases actuarían como señales de localización. Otra característica importante de la doble hélice de ADN-B es dextrógira. Estamos ante una doble hélice, como una estructura de caracol donde el pasamanos son el enlace del azúcar con el fosfato y en el interior de la “escalera” se encuentran las bases. Cada vuelta de la doble hélice son 10 pares de bases donde cada enlace gira en el sentido del movimiento de las agujas del reloj. Figura 17. A. dextrógira; B. levógira.

ADN-A El ADN-A es otra estructura secundaria del ADN. Presenta la misma composición del ADN-B (misma bases) y también es dextrógira, pero presenta otras condiciones física: ➢ Es más ancha y corta. ➢ Las bases nitrogenadas se encuentran más inclinadas. Presentan una disposición más irregular. ➢ Es una estructura que presenta mayor deshidratación (se encuentra en una humedad relativa del 75%, cuando en el ADN-B se encuentra a una humedad del 95%). ➢ Otras condiciones fisiológicas, como por ejemplo el ensamblaje de proteínas a los surcos.

ADN-Z El ADN-Z, a diferencia de las estructuras anteriores, es levógira (tiene un giro antipolar). Los enlaces azúcar-fosfato tienen un discurrir en zig-zag. Esta característica del ADN-Z viene dada porque se dan unos patrones alternantes de la configuración de los enlaces N-glucosídicos, de tal manera que las citosinas tienen un enlace N-glucosídico con una configuración que la llamamos ANTI. La desoxiguanosina tiene una configuración del enlace glucosídico que se llama SYN. Este patrón origina el enlace quebrado de los enlaces azúcar-fosfato.

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ADN B. Las bases están en planos horizontales y el eje los atraviesa por el centro.

ADN A. Es dextrógira, pero las bases están en planos inclinados y el eje no los atraviesa por el centro.

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ADN Z. Es levógira, con enrollamiento irregular en zigzag. Se da donde hay muchas C y G.

Figura 18.

MÉTODOS DE ESTUDIO DE LAS ESTRUCTURAS SECUNDARIAS DEL ADN La molécula de ADN no es una estructura estática. El análisis de difracción de rayos X podría realizar un análisis detallado de la estructura secundaria del ADN. No obstante, estas secuencias eran altamente heterogéneas y ya se empezaba a reconocer que la secuencia primaria podría tener influencia sobre la secundaria. Otra cuestión era que el análisis de refracción de rayos X nos permitía obtener las características globales de la molécula, pero sobre la fibra de ADN no permitía distinguir a átomos específicos porque el ADN estaba en disolución y los enlaces químicos podrían rotar en esa disolución. La segunda metodología sería una consecuencia de la primera. Si tenemos sintetizados oligonucleótidos se podrían cristalizar esos oligonucleótidos y analizar la estructura del ADN mediante cristalografía de rayos X. La ventaja es que al ser cristales los átomos de la molécula de A...