TEMA 3: Cristalografía de proteínas y rayos X PDF

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Apuntes de cristalografía de la UMA. Apuntes de Javier Márquez....

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31/10/2017

TEMA 3: CRISTALOGRAFÍA DE PROTEÍNAS Y RAYOS X ETAPAS EN LA DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA DE UNA PROTEÍNA MEDIANTE DIFRACCIÓN DE RAYOS X Se trata de la escalada de un gran pico. Primero haya que conseguir proteína pura y abundante. (taken from GomézMoreno Caleras, Carlos; Sanz, Javier Sancho. Estructura de proteínas).

OBTENER UNA IMAGEN DE UN OBJETO MICROSCÓPICO ACCIÓN DE LENTES SENCILLAS. First: HUMAN EYE: when we see an object... En un microscopio sencillo, un objeto es iluminado y la lente recolecta los rayos difractados por el objeto O que pasan a través de un foco (F o F’). Como resultado, la lente reconstruye una imagen en I de un objeto en O, de forma que (OF)(IF’) =(FL)(F’L). (taken from Crystallography made crystal clear, G. Rhodes) For a simple lens, the relationship of object position to image position is (OF)(IF’) = (FL)(F’L). Because the distances FL and F’L are constants (but not necessarily equal) for a fixed lens, the distance OF is inversely proportional to the distance IF’.

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OBTENER UNA IMAGEN DE UNA MOLÉCULA

-Necesidad de rayos X -Necesidad de cristales, no moléculas individuales

Analogía cristalográfica de la acción de una lente. Los rayos X difractados del objeto son recibidos y medidos por un detector. Estas medidas se pasan a un ordenador que con un software sofisticado simula la acción de una lente para producir imágenes gráficas del objeto en una pantalla.

Cristalización de proteínas

Azurin (Cu)

Flavodoxina (FMN)

Rubredoxina [Fe(Cys)]

Miohemeritrina (Fe no hemo)

Hb de lamprea (hemo)

Bacterioclorofila (clorofila)

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Cristalización de proteínas: diagrama de fases -CRISTAL def. y difer. -ESTADO CRISTALINO

DIAGRAMA DE FASES PARA UNA PROTEÍNA. LA REGIÓN DELIMITADA POR LA CURVA INFERIOR REPRESENTA EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD DE LA PROTEÍNA.

ESQUEMA MUY SIMPLIFICADO DE LA RELACIÓN ENTRE EL GRADO DE SATURACIÓN Y LA FORMACIÓN DE CRISTALES

CRISTALIZACIÓN DE PROTEÍNAS

CRISTALES DE LISOZIMA. Dependiendo de las condiciones de cristalización usadas, un gran número de cristales más pequeños (a) o un pequeño número de cristales más grandes (b) pueden ser obtenidos.

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REQUISITOS DE LAS PROTEÍNAS Y FACTORES QUE AFECTAN LA SOLUBILIDAD 2) FACTORES UTILIZADOS EN LA OBTENCIÓN DE SOLUCIONES SOBRESATURADAS DE PROTEÍNAS Concentración de la proteína

1) REQUISITOS de la Eliminación del agua PROTEÍNA Cambios en el pH  CONCENTRACIÓN ELEVADA (>10mg/ml)*

Cambios en la temperatura Baja fuerza iónica Alta fuerza iónica (p. ej., (NH4)2SO4)

 PUREZA (95%)  HOMOGENEIDAD  ESTABILIDAD  CANTIDAD (> 5 mg)

Precipitantes poliméricos (p. ej., PEG) Solventes orgánicos:  No volátiles (p. ej., 2-metil-2,4-pentanodiol, MPD)  Volátiles (p. ej., metanol, etanol) Ligandos específicos

CONCENTRACIÓN POR ULTRAFILTRACIÓN Ultrafiltration uses semipermeable membranes to separate components based on selective molecular mass and structure. he solution is contacted ith the membrane under n applied pressure. he applied pressure forces e solvent and the smaller olecules through the embrane. The membrane retains larger molecules. The solution passed through the membrane is the filtrate. The solution containing the retained molecules is the retentate.

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FACTORS AFFECTING PROTEIN’S SOLUBILITY The solubility of proteins is affected by the following factors:

pH (pI)* Temperature** Ionic strength (salt addition) Dielectric constant of the solvent (organic solvent addition)

FACTORS AFFECTING PROTEIN’S SOLUBILITY The solubility of proteins is affected by the pH (pI)*

pI

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FUERZA IÓNICA Y SOLUBILIDAD PROTEICA The ionic strength (I) of a solution is calculated as follows:

Ionic strength = μ = i where: Ci = concentration of the ith species, mole/L Zi= valence (or oxidation) number of the ith species

Protein Crystallization based on salt concentration

μ

SALTING IN Most proteins are soluble at physiological ionic strength (0.9% NaCl) and neutral pH. Solubility is a result of polar interactions with the aqueous solvent, ionic interactions with the salt and, in some extensions, electrostatic repulsion forces between protein molecules of the same charge.  Some proteins, like the globulins, increase their solubility when the salt concentration is increased at a fixed temperature and pH. This behavior shown in the figure is known as salting-in (solubilización por salado).

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Protein Crystallization based on salt concentration μ

SALTING OUT However, the behavior normally shown by most proteins is a considerable decrease of their solubility when salt concentration is raised above one certain point. This is called salting-out (precipitación por salado). If the salt concentrations reach high levels we can achieve that proteins get out of the solution by aggregation and precipitation.  Because different proteins precipitate at different salt concentrations, this can be exploited for protein purification.

Log S = β - KS μ Relación de COHN

METODOLOGÍAS DE CRISTALIZACIÓN DE PROTEÍNAS

A) Diagrama de fase para la cristalización mediada por un agente precipitante. La región rosa representa concentraciones de proteína y precipitante a las cuales la disolución no está saturada con la proteína, de forma que ni la nucleación ni el crecimiento ocurren. Las regiones verde y azul representan soluciones no estables que están sobresaturadas con proteína. B) Una estrategia ideal para crecer cristales grandes es permitir que ocurra la nucleación en la región azul y, entonces, cambiar las condiciones a las de la región verde hasta que cese el crecimiento del cristal.

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MÉTODOS DE CRISTALIZACIÓN DE PROTEÍNAS: difusión de vapor

Cover slip Hanging drop

CRECIMIENTO DE CRISTALES POR EL MÉTODO DE LA GOTA COLGANTE (“HANGING DROP”). La gota que cuelga bajo el cubreobjetos siliconado (“cover slip”) contiene tampón (“buffer”), así como proteína y agente precipitante a menor concentración de la óptima (la que se encuentra en la disolución tampón del reservorio). Arriba a la izda.: Cristalización usando el método de difusión de vapor a partir de una disolución concentrada.

MÉTODOS DE CRISTALIZACIÓN DE PROTEÍNAS: microdiálisis

MICRODIÁLISIS. Una disolución conteniendo las condiciones deseadas (solución externa) difunde a través de una membrana semipermeable en la disolución proteica (difusión líquido-líquido). Las condiciones de la solución externa se pueden variar gradualmente hasta conseguir la cristalización. Derecha: El método de la gota colgante o de la difusión de vapor.

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MÉTODOS DE CRISTALIZACIÓN DE PROTEÍNAS: difusión libre

DIFUSIÓN LIBRE EN LA INTERFASE. Técnica similar a la microdiálisis excepto que no se emplea membrana. Los gradientes de concentración se generan en la interfase lo que origina una sobresaturación local. La técnica es particularmente útil en la microgravedad. Derecha: DIFUSIÓN LÍQUIDO-LÍQUIDO. Una solución saturada de la proteína se coloca en un capilar sellado en contacto con la solución del agente precipitante. La lenta mezcla de ambos componentes junto con la difusión crea un gradiente suficiente del agente precipitante en la solución de la proteína para inducir la cristalización.

CRIOCRISTALOGRAFÍA

Vial y su tapa utilizados para la congelación, almacenamiento y manipulación de cristales en nitrógeno líquido (del catálogo de Hampton Research Corp.). A la derecha, lazo de nylon con un cristal congelado de acetilglutamato quinasa de Pseudomonas aeruginosa (taken from Estructura de Proteínas, Gómez-Moreno, C. y Sancho, J.)

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SIMETRÍA DE LOS CRISTALES

CELDILLA ELEMENTAL O CELDILLA UNIDAD DEFINIDA POR LOS TRES EJES O BORDES (a, b, c) Y POR LOS TRES ÁNGULOS INTERAXIALES (α, β, γ). LOS EJES DEBEN CUMPLIR LA IGUALDAD DEL PRODUCTO VECTORIAL a x b = c. EL APILAMIENTO DE CELDILLAS ELEMENTALES FORMA EL CRISTAL. SISTEMA TRICLÍNICO

SIMETRÍA DE LOS CRISTALES

SEIS CELDILLAS UNIDAD EN UNA RED CRISTALINA. CADA CELDILLA UNIDAD CONTIENE 2 MOLÉCULAS DE Ala EN DIFERENTES ORIENTACIONES. DERECHA, UNA CELDILLA UNIDAD DE LA FIGURA DE LA IZDA. LA POSICIÓN DE UN ÁTOMO EN LA CELDILLA UNIDAD SE ESPECIFICA POR UN CONJUNTO DE COORDENADAS ESPACIALES x, y, z.

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SIMETRÍA DE LOS CRISTALES

El empaquetamiento de una proteína en un cristal con eje de simetría binario: (a) la relación de simetría, (b) el empaquetamiento de la celdilla unidad, y (c) el empaquetamiento en el cristal. Definición: UNIDAD ASIMÉTRICA

SIMETRÍA DE LOS CRISTALES

OPERACIONES DE SIMETRÍA Y ELEMENTOS DE SIMETRÍA EN LA CRISTALOGRAFÍA. DEBIDO A LA QUIRALIDAD DE LAS BIOMOLÉCULAS, (b), (c) and (f) NO OCURREN EN LOS CRISTALES DE PROTEÍNAS Y DNA.

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SIMETRÍA DE LOS CRISTALES

UNA POSIBLE CELDILLA UNIDAD (arriba dcha.) CONTIEN UN PUNTO DE RED POR CELDILLA Y SE DENOMIN ‘PRIMITIVA’ (P). OTRA POSIBLE CELDILLA (izda.) CONTIEN DOS PUNTOS DE RED Y POR TANTO TIENE UNA MAYO SIMETRÍA. AMBAS CELDILLAS SE PUEDEN USAR PAR REPRESENTAR LA RED BIDIMENSIONAL, PERO EN L CRISTALOGRAFÍA 3D SE SELECCIONA LA CELDILLA CO LA SIMETRÍA MÁS ALTA. Definición de PUNTO DE RED.

LOS 7 SISTEMAS CRISTALINOS

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LOS 7 SISTEMAS CRISTALINOS Los parámetros (a, b, c and α, β, γ) que gobiernan las diferentes redes cristalinas, junto con algunos de sus sistemas más simples. Varias permutaciones son posibles dentro de cada sistema y conducen a lo que se denominan celdillas unidad primitivas (contienen 1 sólo punto de red), centradas en la cara (que contienen un punto adicional en el centro de cada cara), centradas en el cuerpo, que contiene un punto adicional en el centro de la celdilla y centradas, que poseen un punto adicional en el centro de cada extremo (siguiente Figura)

LAS 14 REDES DE BRAVAIS

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LOS 230 GRUPOS ESPACIALES 7 SISTEMAS CRISTALINOS P

I

C

F

14 REDES DE BRAVAIS

+

32 CLASES CRISTALINAS (grupos puntuales)

230 GRUPOS ESPACIALES (65) (tabulados) EL CONJUNTO DE ELEMENTOS DE SIMETRÍA QUE PASAN POR UN PUNTO: GRUPO PUNTUAL DE SIMETRÍA (define la simetría total de los objetos). GRUPOS PUNTUALES DE SIMETRÍA POSIBLES EN LOS CRISTALES: SÓLO 32, DENOMINADOS CLASES CRISTALINAS

ÍNDICES DE LOS PLANOS ATÓMICOS EN UN CRISTAL DEFINICIÓN ÍNDICES DE MILLER (h,k,l) ÍNDICES DE MILLER DE LAS CARAS DE DOS CELDILLAS ORTORRÓMBICAS

Todos los planos que están en la cara ab (xy) tendrán los índices de Miller (001), por ejemplo la cara de la celdilla unidad que está enfrente de nosotros y que es paralela a la indicada en la figura como (001). De forma análoga, para las caras (100) que están en la cara bc (yz), a la izquierda y derecha de la figura, y las caras (010) situadas abajo y arriba de la celdilla y que están sobre la cara ac (xz).

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ÍNDICES DE LOS PLANOS ATÓMICOS EN UN CRISTAL: red bidimensional

ÍNDICES DE MILLER PARA CONJUNTOS DE PLANOS CRISTALINOS EN UNA RED BIDIMENSIONAL

GENERACIÓN DE RAYOS X (Roentgen)

FUENTES DE RAYOS X. El bombardeo de un ánodo de Cu mediante un rayo de electrones desplaza electrones del nivel inferior del átomo de Cu. Electrones de capas atómicas superiores ocupan esas vacantes y emiten rayos X de diferentes λ. Derecha: transiciones de la banda K y espectro de emisión del Cu y espectro de absorción del Ni.

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GENERACIÓN DE RAYOS X

PRODUCCIÓN DE RAYOS X EN EN LABORATORIO. SE PRODUCE UNA AMPLIA DISTRIBUCIÓN DE RAYOS X Y DOS PICOS CORRESPONDIENTES A LA TRANSICIÓN Kα y Kβ

GENERACIÓN DE RAYOS X

(A) TUBO DE RAYOS X. (b) FUENTE CON ÁNODO ROTATORIO.

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GENERACIÓN DE RAYOS X: SINCROTRÓN

ESQUEMA DEL SINCROTRÓN THE ADVANCED LIGHT SOURCE (LAWRENCE BERKELEY NATIONAL LABORATORY, BERKELEY, CA, USA (http://www-als.lbl.gov)

GENERACIÓN DE RAYOS X: SINCROTRÓN

DISPOSICIÓN DE LOS CENTROS DE COLECCIÓN DE DATOS ALREDEDOR DE UN ANILLO DE ALMACENAMIENTO DE PARTÍCULAS SINCROTRÓN

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INSTRUMENTACIÓN DE RAYOS X

DISPOSITIVO EXPERIMENTAL (IZDA.) Y ESQUEMA (DCHA.) PARA LA OBTENCIÓN DE DATOS POR DIFRACCIÓN DE RAYOS X

DIFRACCIÓN DE ONDAS LUMINOSAS

θ

Perpendicular al rayo inferior

a sen θ

LAS ONDAS SE PUEDEN COMPONER UNAS CON OTRAS: A) CONSTRUCTIVAMENTE (resultante verde izda.) B) DESTRUCTIVAMENTE (resultante azul dcha.) .

DIFRACCIÓN A PARTIR MÚLTIPLES RENDIJAS (SLITS).

DE

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LEY DE BRAGG DERIVACIÓN DE LA LEY DE BRAGG. La difracción se ve como una reflexión de rayos X desde planos reticulares adyacentes

LEY DE BRAGG

W.L. Bragg en 1915

CONDICIONES QUE PRODUCEN RAYOS X DIFRACTADOS INTENSOS. NÓTESE COMO AL CUMPLIRSE LA LEY DE BRAGG, LA ONDA DIFRACTADA DESDE EL PLANO SUPERIOR TIENE MAYOR AMPLITUD QUE LA DEL PLANO INFERIOR DEBIDO A LA INTERFERENCIA CONSTRUCTIVA

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CONSTRUCCIÓN DE LA RED RECÍPROCA

CONSTRUCCIÓN DE LA RED RECÍPROCA. LOS PUNTOS DE RED REALES SON CRUCES ROJAS Y LOS PUNTOS DE LA RED RECÍPROCA SON PUNTOS VERDES, NÓTESE LA DENOMINACIÓN DE LOS EJES RECÍPROCOS b* y a*

EL ESPACIO RECÍPROCO a* = b x c / V cos α* = (cosβ cosγ – cosα) / senβ senγ b* = a x c / V cos β* = (cosα cosγ – cosβ) / senα senγ c* = a x b / V cos γ* = (cosα cosβ – cosγ) / senα senβ

CELDILLAS UNIDAD RECÍPROCAS (VERDES) DE CELDILLAS REALES GRANDES Y PEQUEÑAS (ROSAS). NÓTESE QUE LOS EJES RECÍPROCOS a*, b* y c* ESTÁN ALINEADOS CON LOS EJES REALES a, b y c (si los ejes reales son ortogonales).

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CÍRCULO (ESFERA) DE EWALD (Bragg’s law in reciprocal space)

INTERPRETACIÓN DE LA DIFRACCIÓN SEGÚN EL MODELO DE EWALD. CUANDO UN PUNTO RECÍPROCO P(hkl) SE SITÚA SOBRE LA SUPERFICIE DE LA ESFERA DE RADIO 1/λ SE GENERA UN HAZ DIFRACTADO QUE EMERGIENDO DEL CENTRO DE LA ESFERA PASA POR P(hkl)

CÍRCULO (ESFERA) DE EWALD (Bragg’s law in reciprocal space)

2θ 2θ

INTERPRETACIÓN DE LA DIFRACCIÓN SEGÚN EL MODELO DE EWALD. CUANDO UN PUNTO RECÍPROCO P(hkl) SE SITÚA SOBRE LA SUPERFICIE DE LA ESFERA DE RADIO 1/λ SE GENERA UN HAZ DIFRACTADO QUE EMERGIENDO DEL CENTRO DE LA ESFERA PASA POR P(hkl)

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ONDAS COMO VECTORES, VECTORES COMO NÚMEROS COMPLEJOS

UNA ONDA SE DESCRIBE POR SU AMPLITUD, f, Y SU ÁNGULO DE FASE ψ

REPRESENTACIÓN DE UNA ONDA COMO UN VECTOR Y SU EXPRESIÓN COMO UN NÚMERO COMPLEJO

Una onda coseno y otra seno está relacionadas de forma simple por un ángulo de fase de 90º or π/2 radianes.

EL FACTOR DE ESTRUCTURA F

EL FACTOR DE ESTRUCTURA F (verde) ES EL VECTOR SUMA DE LOS TRES FACTORES DE ESTRUCTURA A) EL FACTOR DE ESTRUCTURA F REPRESENTADO ATÓMICOS f1, f2, and f3 (negro) COMO UN VECTOR EN EL PLANO DE LOS NÚMEROS COMPLEJOS. B) EL VECTOR F GIRANDO A LO LARGO (Ejemplo de una estructura de 3 átomos) DE SU LÍNEA DE PROPAGACIÓN

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EL FACTOR DE ESTRUCTURA F

A) EL FACTOR DE ESTRUCTURA F REPRESENTADO COMO UN VECTOR EN EL PLANO DE LOS NÚMEROS COMPLEJOS. SU MÓDULO O LONGITUD Y SU ÁNGULO DE FASE SON INDICADOS

EL VECTOR FACTOR DE ESTRUCTURA RESULTANTE ES EL SUMATORIO DE LOS FACTORES DE ESTRUCTURA ATÓMICOS, QUE REPRESENTAN LA ONDA DISPERSADA POR CADA ÁTOMO Y QUE ORIGINAN EL FACTOR DE ESTRUCTURA PARA CADA REFRACCIÓN

EL PROBLEMA DE LA FASE: MIR

MÉTODO MIR: PATRONES DE DIFRACCIÓN DE LA PROTEÍNA P Y SU DERIVADO CON ÁTOMO PESADO PH

EL FACTOR DE ESTRUCTURA FPH PARA EL DERIVADO PH ES LA SUMA DE LAS CONTRIBUCIONES DE LA ESTRUCTURA NATIVA (FP) Y LA QUE CONTIENE ÁTOMOS PESADOS (FH). COLORES: PROTEÍNA NATIVA VERDE, DERIVADO CON ÁTOMOS PESADOS, ROJO, Y ÁTOMOS PESADOS SOLOS, AZUL

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EL PROBLEMA DE LA FASE: MIR

DIAGRAMAS DE HARKER CON LOS FACTORES DE ESTRUCTURA PARA FP, FPH y FH: puesto que la diferencia entre los dos vectores FP y FPH es sólo el vector FH , si el círculo asociado con FPH (círculo verde de la figura de la izda.) se desplaza por el vector -FH (figura de la dcha.) los puntos donde los dos círculos intersectan satisfacen la ecuación vectorial.

EL PROBLEMA DE LA FASE: MIR Ι FPH Ι - FH

DIAGRAMAS DE HARKER SEÑALANDO DOS POSIBLES FASES PARA FP QUE SATISFACEN LA ECUACIÓN: FP = FPH – FH: sólo los puntos donde los dos círculos intersectan satisfacen la ecuación vectorial. Todos los puntos del círculo rojo satisfacen la suma vectorial:

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EL PROBLEMA DE LA FASE: MIR FP = F’PH – F’H

Ꞌ

Ꞌ

UN SEGUNDO DERIVADO PH’ INDICA DOS POSIBLES FASES PARA LA PROTEÍNA P, CONFIRMANDO α (FPC) COMO LA FASE CORRECTA PARA ESTA REFLEXIÓN, QUE COINCIDE CON LA FASE DE FpA DE LA FIGURA ANTERIOR. DERECHA: SOLUCIÓN MIR MOSTRANDO FASES DE GRAN INCERTIDUMBRE

Cristales de Mioglobina y Fotografía de Rayos X del cristal

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DETERMINACIÓN ESTRUCTURAL POR CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X

DETERMINACIÓN ESTRUCTURAL POR CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X (taken from Protein Structure and Function, G. Petsko & D. Ringe) El primer paso es la cristalización de la proteína. Los cristales son bombardeados con rayos X que se dispersan desde los planos del enrejado cristalino y se capturan como patrón de difracción en un detector (película fotográfica o un dispositivo electrónico). A partir de este patrón, se construyen mapas de densidad electrónica (mostrados aquí con el correspondiente péptido superpuesto) y un modelo de la proteína a partir de ellos. Este modelo se refina y se ajusta para reducir la diferencia entre su patrón de difracción calculado y el patrón obtenido del cristal, hasta que la correspondencia entre el modelo y la realidad sea la mejor posible. La calidad de la determinación estructural se mide como porcentaje de diferencia entre el patrón calculado y el actual.

DEFINICIONES COORDENADA ATÓMICA: la posición en el espacio 3D de un átomo en una molécula y en relación con todos los átomos de esa molécula. MAPA DE DENSIDAD ELECTRÓNICA: una gráfica de contorno mostrando la distribución de los electrones alrededor de los átomos de una molécula. RESOLUCIÓN: el nivel de detalle que se puede derivar de un proceso dado (ángulo máximo de Bragg). EXACTITUD y PRECISIÓN: Es esencial apreciar la distinción entre la exactitud de una estructura determinada experimentalmente y su precisión. La última es mucho más fácil de evaluar que la primera. Definimos la precisión de una determinación estructural en términos de la reproducibilidad de sus coordenadas atómicas. Si los datos permiten determinar precisamente la posición de equilibrio de cada átomo, entonces la misma estructura determinada de forma independiente en labs diferentes debería rendir las mismas coordenadas atómicas, lo que suele ocurrir con una precisión de décimas de Aº...