Teoría Nº 9 - Procesamiento del ARN PDF

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Biología Celular y Molecular

Teoría Nº 9: Procesamiento del RNA Se denomina transcripto primario, al RNA tal cual es sintetizado por la RNA polimerasa. Y a menudo, ocurre que ese transcripto primario no es idéntico al RNA funcional, llamado RNA maduro. Para dar lugar a ese RNA maduro, el transcripto primario debe sufrir una serie de modificaciones y se habla entonces de procesamiento del RNA.

En Eucariotas, todo el RNA sufre procesamiento. En Procariotas, los RNA ribosomales y los RNA de transferencia, son los que si sufren procesamiento, mientras que los RNA mensajeros, en general no sufren ningún tipo de procesamiento, porque tal cual son sintetizados son funcionales. Esto, es lo que permite que estén acopladas la transcripción y la traducción. Ni bien empieza a sintetizarse el transcripto, ya puede empezar a traducirse. En Eucariotas no, los RNA mensajeros maduros son diferentes a los transcriptos primarios. Lo que vamos a ver ahora, es que tipo de procesamiento sufren estos transcriptos primarios que van a dar lugar RNA mensajeros en Eucariotas (recuerden que eran los productos de la transcripción por parte de la RNA Polimerasa II). Procesamiento del RNA mensajero: En eucariotas, a medida que transcurre la transcripción las moléculas de mRNA, llamadas transcriptos primarios, son modificadas. Esto ocurre antes de que sean transportadas al citoplasma (sitio donde ocurre la traducción). Las modificaciones son varias e incluyen: 1) Adición del CAP: Un nucleótido modificado CAP se añade al extremo 5’ del mensajero. Este “casquete” es imprescindible para la unión del mRNA al ribosoma y protege al mRNA de la degradación. 2) Poliadenilación: En el extremo 3’ del mRNA hay una secuencia señal (AAUAAA) a la que se unen factores específicos y la enzima Poli A Polimerasa. Esta enzima estimula la ruptura en un sitio ubicado 10 a 35 nucleótidos hacia el extremo 3’ de la señal. Luego, la enzima agrega dé a uno, nucleótidos de adenina y así se genera el extremo 3’ del mRNA maduro. Esta cola de Poli A, contiene entre 200-250 nucleótidos. 3) Splicing: Durante la transcripción el mRNA sufre un proceso de corte y eliminación de secuencias, llamadas intrones, y el posterior empalme de las secuencias restantes, los exones. En el primer paso, se unen al mRNA inmaduro unas pequeñas partículas de RNA nucleares asociadas con proteínas denominadas snRNP (Small Nuclear Ribonucleo-Protein Particles). Los snRNP se unen a secuencias cortas ubicadas entre los intrones y los exones. Luego se añaden más proteínas y forman un gran complejo con el RNA que se denomina Spliceosoma. Además, de desempeñar funciones de reconocimientos de esas secuencias, las snRNP llevan a cabo funciones catalíticas. El proceso de splicing, catalizado por Spliceosoma, ocurre sólo en organismos eucariotas. Las secuencias que se eliminan son los intrones mientras que las secuencias que permanecen y forman parte del mRNA maduro son los exones.

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Biología Celular y Molecular Primera modificación: Adición del CAP al extremo 5’. Esta estructura, es lo que en ingles se llama el CAP o caperuza, es importante para que el RNA mensajero sea estable, para que sea transportado del núcleo al citoplasma, y para el proceso de traducción del RNA mensajero. Dijimos que el CAP es agregado en forma post transcripcional. Segunda modificación: Adición de la cola de Poli A. Otro tipo de modificación, que sufren los RNA que van a dar lugar a RNA mensajeros, es la Adición de la cola de Poli A que ocurre en el extremo 3’. Todos los RNA mensajeros, salvo los RNA mensajeros de histonas, tienen en su extremo 3’ una cola de Poli A. ¿Qué es la Cola de Poli A? Es una sucesión de nucleótidos de Adenina y tiene un promedio de 200 nucleótidos. La cola de Poli A, es importante para la estabilidad del RNA mensajero, participa pero no es tan importante en el transporte al citoplasma y es importante para la traducción también. Las dos estructuras son requeridas para tener un RNA mensajero funcional. ¿Cómo se determina el agregado de la cola de Poli A? Hay señales en el RNA que indican donde debe ocurrir la adición de la cola de Poli A. Hay una señal muy importante, que está ubicada a unos 10-35 nucleótidos corriente arriba, o sea, hacia el 5’ del RNA, en la región que va a permanecer en el mensajero maduro. Esta región conservada, es la que se denomina señal de poliadenilación porque se agregan muchas adeninas, se adenila el RNA. Y tiene la secuencia consenso que está indicada acá, AAUAAA. Si esta señal es anulada, la adición de la cola de Poli A no se produce, es más, el RNA tampoco se corta acá. Esta señal de poliadenilación, es necesaria para los dos procesos, el corte y el agregado de la cola de Poli A. Y corriente abajo del sitio de poliadenilación, más o menos unos 50 nucleótidos corriente abajo, hay una región que no es esencial pero que si es importante para que el proceso ocurra eficientemente, es una región rica en GU.

¿Cómo ocurre este proceso? Necesitamos un Factor de Especificidad del Corte y la Poliadenilación que reconozca esta secuencia específicamente para decir, acá es donde hay que cortar. El Factor de Especificidad del Corte y la Poliadenilación, es una proteína que une RNA reconociendo esa secuencia. Al reconocer esa secuencia, se une allí y determina donde se va a cortar el DNA. Se une a la secuencia específica, reconociéndola, y dice, el RNA se va a cortar más o menos unos 10-35 nucleótidos hacia 3’. ¿Después que más va a hacer falta? Va a ser falta una endonucleasa que corte el RNA en esa región. Una endonucleasa es una enzima que corta enlaces fosfodiéster, en regiones internas de un RNA. El lugar de corte lo va a guiar porque esta endonucleasa se va a unir al otro factor, entonces va a cortar ahí. ¿Qué más vamos a necesitar? Algo que agregue la cola de Poli A. Que es una enzima que se llama la Poli A Polimerasa. La Poli A Polimerasa es una enzima que agrega dé a uno nucleótidos de Adenina, usando ATP como sustrato. O sea, tenemos el RNA con su extremo 3’ hidroxilo generado por el corte endonucleolítico con ATP, se va a perder pirofosfato, esto es como siempre, y va a quedar el nucleótido de Adenina unido al extremo 3’ del RNA. La Polimerasa hace esto unas doscientas veces y agrega A al extremo 3’. Acá está más o menos ejemplificado el proceso. Acá están todas las enzimas que participan que son las que yo les nombre antes. Este es el factor de especificidad, está en rojo, esto de acá es el factor de corte y esta que esta acá es la Poli A Polimerasa. Y finalmente, hay otro factor requerido que es un factor que está compuesto por dos subunidades y que se llaman CF I Y CF II, es un factor que estimula el proceso y que se une a esta secuencia rica en GU y que está hacia el extremo 3’.

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Primero, se forma todo el complejo entre todas las proteínas y una vez que se forma todo este complejo, incluida la Poli A Polimerasa, se produce el corte del RNA en una región determinada y junto con el corte se produce la poliadenilación, (la adición de Adeninas). Son dos procesos acoplados. Luego del corte, el factor de especificidad queda unido, la RNA Polimerasa obviamente se va moviendo a medida que va sintetizando y recién en ese momento, se puede romper este complejo.

La poliadenilación en realidad ocurre en dos etapas: Primero hay una etapa en la cual se agregan unos 20 nucleótidos, unas 20 A. Una vez que se unen unas 20 A, se une al RNA otra proteína que se llama Poli A binding protein II (color celeste), esta se une a la cola de Poli A con 20 A. Una vez que se une esta proteína la Poli A Polimerasa, interacciona con esta proteína y ahí agrega las otras 180 A que faltan. Para esta segunda etapa ya no hace falta el factor de especificidad que si es requerido en la primera etapa. Una vez que el RNA adquirió unas 20 A, y que se unió la Poli A binding protein II, ya la Poli A Polimerasa al unirse esta proteína agrega las 200 A. En definitiva, la Poli A Polimerasa no le va a agregar una cola de Poli A a cualquier extremo 3’ de cualquier RNA. Primero se adhieren todos al RNA, después se corta el RNA y la Poli A Polimerasa agrega unas veinte A. Lo que les decía que la Poli A Polimerasa, no va agregar una cola de Poli A a cualquier RNA. Necesita que otra proteína la atraiga al sitio de poliadenilación. Al principio este complejo y sobre todo el factor de especificidad es lo que hace que solo los RNA que tengan esa secuencia sean poliadenilados. En una segunda etapa, lo que la atrae es la Poli A binding Protein (PABP II) que está unida a la pequeña cola de Poli A, eso une a la Poli A Polimerasa y se agregan más RNA. O sea, que un DNA que tenga unas pocas Adeninas si va a ser substrato de la Poli A Polimerasa y la Poli A Polimerasa va a alargar esa cola de Poli A. Estos son dos de los procesamientos que sufren los RNA mensajeros. El tercer procesamiento es la Eliminación de Intrones. Ustedes saben que normalmente los genes Eucariotas tienen lo que se denominan exones e intrones. Los exones son las regiones del gen o las regiones de un RNA que van a formar parte del RNA mensajero maduro funcional y los intrones son las regiones que van a ser removidas. La mayoría de los genes Eucariotas superiores, levaduras no tanto, pero en Eucariotas superiores, como en mamíferos o en algunas plantas, la mayoría de los genes tienen intrones. Hablamos de genes que codifican proteínas. La cuestión, es que los intrones a menudo están metidos dentro de la secuencia codificante de los genes y por lo tanto, interrumpen las secuencias codificantes para las proteínas. Por ejemplo:

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Biología Celular y Molecular Ahí está lo que es el transcripto primario, lo que se llama el PRE-RNA mensajero que codifica para la β globina. La β globina es uno de los componentes, uno de los polipéptidos, que componen la hemoglobina que es la proteína que transporta el oxígeno en la sangre. Este mensajero tiene dos intrones, el codón de iniciación AUG y el codón de terminación. Fíjense, la A y la G están de este lado del intrón y la G siguiendo el codón está de aquel lado del intrón. O sea, que no solo interrumpe un marco de lectura, si no que se interrumpe un codón. Entonces si los intrones no son removidos, este RNA no va a codificar la proteína que tiene que codificar, y va a codificar cualquier otra cosa. Si el intrón es mal removido, y aparte se agrega un nucleótido más o un nucleótido menos, a partir de allí va a cambiar el marco de lectura y la secuencia e codones va a ser diferente, entonces, tampoco la proteína codificada va a ser funcional. Por lo tanto, no solo estos intrones deben ser removidos, sino que deben ser removidos muy precisamente para dar lugar a una proteína funcional. Les repito la definición de exón: exón tiene que ver con lo que queda en el RNA mensajero final. Ustedes suelen asimilar exón a secuencias codificantes, esto es cierto en la mayoría de los casos, pero no siempre, porque los RNA no tienen solo secuencias codificantes, aun en RNA maduros tienen una región en su extremo 5’ y en su extremo 3’ que no es codificante. La región codificante, está más hacia adentro entre el codón de iniciación y el de terminación. Por lo tanto, acá el exón 1 tiene una parte que es no codificante y el último exón también va a tener una parte que es no codificante. A su vez, los intrones suelen tener siempre secuencias no codificantes. Pero pueden haber intrones que tengan secuencias codificantes y vamos a ver más adelante que pueden haber intrones con secuencias codificantes. Porque puede haber intrones que a veces son removidos y a veces no. Y entonces para un RNA mensajero, para uno de los RNA mensajeros generados va a ser un intrón y para otros se podría decir que es un exón o por lo menos va a tener una secuencia codificante. ¿Cómo se produce la remoción de los intrones? Uno espera que si este proceso tiene que ser muy preciso existan señales en los intrones o en los exones en algún lugar del RNA que indique que acá termina el exón y acá empieza el intrón. Si uno analiza muchas secuencias de intrones y de exones cercanas a los intrones, ve que en realidad no hay muchas secuencias conservadas. Si suelen ocurrir, que los dos primeros nucleótidos del intrón casi siempre, por no decir siempre, son GU, los dos primeros quiero decir los del extremo 5’, y los dos últimos los el extremo 3’ son casi siempre o siempre AG. A su vez, por fuera hay una conservación parcial en unos pocos nucleótidos tanto en el extremo 5’ como en el extremo 3’. Pero fíjense acá están los porcentajes, o sea que muchos de los nucleótidos que no son esenciales.

En general si esta G, U, A o G que están de color verde, son removidas, el Splicing no se produce.

Tercera Modificación: Splicing El Splicing es el proceso de remoción de intrones. También se lo conoce como procesamiento por corte y empalme, que no es del todo correcto. ¿Qué es lo que pasa durante el proceso de Splicing? No solo tiene que removido el intrón si no que tienen que juntarse los dos exones que están por afuera para regenerar el marco de lectura. No es solo sacar el intrón sino juntar los dos exones que están por afuera. En realidad, hay otras secuencias importantes, pero que no están muy conservadas. Por ejemplo, unas 20-50 bases corriente arriba hacia el extremo 5’ del extremo 3’ del intrón hay una zona rica en pirimidinas, C o U. Un poco más cercano a ellos, un poco más arriba, hay una secuencia más o menos conservada pero que tiene una cosa importante,

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Biología Celular y Molecular tiene una A que si es importante para el proceso de Splicing. Esta A es lo que se llama el sitio de ramificación del intrón. ¿Cómo ocurre el proceso de Splicing? Esta A (Adenina) es la que yo les marqué acá y que es el sitio de ramificación del intrón. Esta Adenina está unida por tres enlaces fosfodiéster, por sus extremos 5’y 3’ al nucleótido anterior y al nucleótido posterior del intrón y por su hidroxilo 2´ al extremo 5’ del intrón. Y esto, es realmente un intermediario en el proceso de Splicing. El Splicing ocurre en dos etapas:

 La primera etapa, es precisamente la ruptura del enlace entre el extremo 3’ del exón 1 y el extremo 5’ del intrón, acoplada a la formación del enlace entre el hidroxilo 2’ de la adenina del sitio de ramificación y el extremo 5’ del intrón. Es decir, que se rompe la unión intrón con exón, todo en una sola etapa, se rompe la unión entre el exón 1 y el intrón, y se forma una unión entre el extremo 5’ de intrón y el hidroxilo 2’ de la Adenina del sitio de ramificación. Esto ocurre en una sola etapa, y entonces es una reacción de transesterificación, se rompe un enlace fosfodiéster y se genera un enlace fosfodiéster. Y esto se produce precisamente porque el hidroxilo 2’ de la adenina ataca esa unión rompiéndola y formando un nuevo enlace.  La segunda etapa, es otra reacción de transesterificación. El extremo 3’ hidroxilo del primer exón ataca la unión entre el intrón y el exón 2. Se rompe la unión entre el intrón y el exón 2, y se genera la unión entre los dos exones. Finalmente queda formado el RNA mensajero maduro y el intrón separado en forma de lazo, esta estructura se llama forma de lazo, y después es degradado el intrón. En principio, queda como lazo, después esa unión se rompe y el intrón es degradado. Este proceso es catalizado por una estructura que está en el núcleo y que se llama el Spliceosoma. Este cataliza las dos reacciones de transesterificación. El Spliceosoma, está formado por muchas proteínas y unos cuantos RNA’s. Los RNA’s que forman parte del Spliceosoma son unos RNA’s que se llaman RNA’s pequeños nucleares, snRNA. Son unos RNA’s de unos 100 nucleótidos. Y como son ricos en Uridina se llaman UsnRNA. Cada uno tiene un número diferente. U1, U2, hay un U3 pero no participa del Splicing, un U4, un U5 y un U6. Cada uno de esos RNA’s están unidos a una serie de proteínas especificas formando lo que se llaman ribonucleoproteinas, entonces la ribonucleoproteínas pequeña nuclear que tiene el RNA 1 se llama U1snRNP, que es una agrupación entre este RNA y una serie de proteínas. Todas esas partículas que vemos acá se agrupan formando el Spliceosoma que es lo que cataliza el proceso de Splicing.

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Biología Celular y Molecular Cada una tiene funciones específicas. U1 reconoce el extremo 5’ del intrón. U2 reconoce el sitio de ramificación. U3 no actúa en el splicing. U4 es un inhibidor de U6. Eso quiere decir que si esta U6 unida a U4 el Splicing no se produce.  U5 también reconoce los extremos del intrón y mantiene los dos exones y los dos extremos del intrón juntos.  U6 es la que cataliza las reacciones de transesterificación, las reacciones de Splicing. Entonces primero se arma todo el complejo y en un determinado momento U4 se libera y cuando se libera U4, U6 cataliza las reacciones y se produce el Splicing.    

Dijimos que la remoción de intrones tiene que producirse en forma muy precisa y que depende en definitiva de determinadas secuencias presentes en los RNA’s. Esas secuencias, tienen que ser de alguna manera reconocidas para decir, bueno acá está el intrón, acá está el sitio de ramificación, acá termina el intrón. Esos reconocimientos, dependen de interacciones RNA-RNA, entre el RNA mensajero y los snRNA. Es decir, por interacción, por complementariedad de bases. Secuencias del intrón, sobre todo, sitio de ramificación, el extremo 5’ del intrón con los snRNA. Dijimos que U1 reconoce el extremo 5‘, si lo reconoce es porque tiene una región que es complementaria al extremo 5’ del intrón. U2 reconoce el sitio de ramificación porque tiene una región que es complementaria al sitio de ramificación precisamente. Y a su vez U2, tiene otra región que es complementaria a U6, entonces U2 interacciona por un lado con el sitio de ramificación, por otro lado con U6 y lo fija en el sitio adecuado para hacer las reacciones. La especificidad del proceso de Splicing, está dada por interacciones RNA-RNA entre el RNA mensajero o el RNA a ser procesado, sobre todo secuencias de intrón, y los snRNA. Todos estos procesamientos que sufre el RNA mensajero, como la adición del CAP, la cola de Poli A y el Splicing, ocurren en el núcleo, antes que el RNA sea transportado al citoplasma. Y se ha visto más recientemente, que todos estos procesos están acoplados, de alguna manera, al proceso de transcripción. Dijimos que los otros RNA también son procesados, como los RNA ribosomales y los RNA de transferencia. Acá tienen el caso de los RNA ribosomales. Se acuerdan que habíamos hablado de una única unidad transcripcional que empezaba por acá y terminaba por acá y que comprendía tres de los RNA ribosomales, el 18s, el 5.8s y el 25s. O sea, acá se genera un único RNA que abarca toda esta zona y después si tiene que ser cortado en esas regiones para generar los RNA funcionales. Este proceso como ustedes tienen ejemplificado acá es bastante complejo, comprenden un montón de cortes para dar lugar a los RNA finales. Son cortes endonucleolíticos, acá se cortan uniones fosfodiéster en determinadas regiones de los RNA. Y hay un montón de proteínas involucradas en esto procesos, estos circulitos que tienen allí son un montón de proteínas que actúan. Todo este procesamiento que da lugar a los RNA ribosomales ocurre en una estructura especial del núcleo que es el Nucléolo, que es también donde se produce la transcripción por parte de la RNA Polimerasa I, que era la enzima que transcribía los genes de RNA ribosomales. Durante este proceso entonces, se van cortando los RNA para dar los RNA ribosomales funcionales y también se van agregando las proteínas ribosomales, las proteínas que van a formar parte del ribosomas. Entonces, se ensamblan en el mismo nucléolo por un lado la subunidad mayor del ribosoma, por el otro la subunidad menor del ribosoma, con los RNA y las proteínas correspondientes. Luego, esas subunidades son exportadas, a través de los poros nucleares al citosol que es el lugar donde van a actuar los ribosomas.

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Splicing del tRNA: Los RNA que van a dar lugar a los RNA de transferencia también son procesados. Acá estaría ejemplificado un transcripto primario que va a dar lugar a un RNA de transferencia, estos son sintetizad...