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Informe de practica de laboratorio para analizar actividad de operon lactosa en distintas condiciones de cultivo./Laboratory practice report to analyze lactose operon activity in different culture conditions....

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ABAJO PRÁCTICO N°7: Regulación de la expresión génica en procariotas E. coli. Luciana Chamorro

TRABAJO PRÁCTICO N° 7: Regulación de la expresión génica en procariotas Regulación del operón Lac en E. coli Luciana Chamorro

RESUMEN Se estudió la actividad del operón lactosa en distintas condiciones de cultivo en bacterias de Escherichia coli. Se pudo comprobar que el operón induce la síntesis de β galactosidasa en presencia de lactosa o de algún análogo siempre y que esta síntesis se ve afectada ante la disponibilidad de glucosa. No fue posible comprobar la inhibición de la síntesis enzimática en ausencia de lactosa. INTRODUCCIÓN La información del ADN organizada en genes aporta las instrucciones para, a través de la transcripción y la traducción, la síntesis de proteínas, muchas de las cuales funcionan como enzimas. Estas cumplen funciones diversas vitales y son requeridas para el metabolismo celular. Dado que el consumo energético de la síntesis de proteínas es elevado su regulación es indispensable. Por otra parte, la expresión génica se regula según el tipo celular, estadio de desarrollo y condiciones externas. (1) Existen múltiples estrategias de regulación, por ejemplo, la bacteria E. coli como organismo unicelular que es no puede desplazarse para buscar alimento cuando escasea ni alterar las condiciones externas que pueden limitar la disponibilidad de sustrato. Esta situación es compensada por la capacidad de E. coli de poder degradar múltiples partículas. Por ejemplo, en presencia de glucosa la degradará, si dispone de lactosa, maltosa, xilosa, etc sintetizará una enzima específica que permita usar el azúcar disponible como

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alimento. La posibilidad de sintetizar múltiples enzimas para una misma función representa una ventaja, sin embargo, si no fuese una actividad altamente regulada resultaría antieconómico desde el punto de vista energético. (2) En este sentido el control del inicio de la transcripción “permite el máximo ahorro de energía evitando toda síntesis de productos no requeridos” (3). Este control transcripcional en bacterias es gestionado por operones: grupo de genes estructurales que se transcriben juntos (incluyendo su promotor y secuencias que regulan transcripción). Los operones pueden ser inducibles o reprimibles. En los primeros la transcripción suele estar desactivada, algo debe suceder para activar la transcripción, En los otros algo debe suceder para reprimir la transcripción. Para el metabolismo de la lactosa el operón lac es la base del control de transcripción en bacterias. Para utilizar lactosa como alimento la bacteria debe transportarla en forma activa hacia su interior y degradarla a glucosa, galactosa y alolactosa. Las enzimas que catalizan tales actividades son producidas por el operón: permeasa, β- galactosidasa y una tercera enzima tiogalactósido transacetilasa cuya función aún no se conoce con claridad. El operón lac es inducible negativo en el cual sus genes se transcriben a menos que la proteína represora (Lac 1) esté unida al promotor. Presenta los siguientes elementos: Gen lac z: codifica la enzima β-galactosidasa. Gen lac y: codifica la proteína galactósido permeasa. Gen lac a: codifica la enzima tiogalactósido transacetilasa. Gen represor (lac I): codifica la proteína represora Lac I, que impide la transcripción de los genes bajo el control de este promotor, pero estimula la unión de la RNA polimerasa. Cuando el represor se retira (en presencia de lactosa o IPTG), la RNA polimerasa queda lista para empezar la transcripción. Promotor: reconoce la RNA polimerasa para llevar a cabo la transcripción. Operador: reconocido por la proteína represora Lac I. La lactosa, aunque en verdad es la alogalactosa, induce al operón. En su 2

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ausencia Lac 1 permanece unida impidiendo la transcripción de los genes (2).

Ilustración 1 Estructura del operón lac y sus elementos de control.

El objetivo de la práctica fue estudiar las condiciones de inducción en E. coli. MATERIALES Y MÉTODOS Se siguieron los protocolos de las Guía de Trabajo Práctico N° 7, Introducción a la Biología Celular y Molecular, Comisión Tarde. RESULTADOS La Tabla 1 resume las condiciones experimentales con las que se trabajó.

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Para el caso el medio de cultivo de las baterías estudiadas no contenía glucosa, dado que este carbohidrato es preferido por la bacteria y reprime la síntesis de β galactosidasa, que es la enzima de interés para este trabajo. Tubo No Cultivo

1

2

3

4

5

6

7

0,2 0,2 0,2 0,2

0,2

0,2

-

Solución fisiológica

1 0,8 0,8 0,8

0,8

0,6

1

IPTG (40 mM)

- 0,2

-

-

Lactosa (5%) Cloranfenicol 30 mg/ml

-

- 0,2 0,2 0,2 - 0,02

0,2 0,2 -

Glucosa (10%)

-

-

0,2

-

-

-

-

-

-

-

Tabla 1

El tubo 7 sirvió como blanco para evaluar en qué medida la absorbancia de la solución fisiológica y lactosa alteran la lectura. En el tubo 2 se agregó IPTG (Isopropil tiogalactósido) que es un análogo sintético de la lactosa, que no es degradado por β galactosidasa. Dado que el operón es activado por lactosa o por alolactosa, para este trabajo tiene la función de reemplazar a la lactosa como inductor del operón con la ventaja de que no es degradado por la enzima y no requiere transporte activo de la permeasa (4). Luego de inducir al operón lac se midió la absorbancia a 600 nm. Esto es necesario porque para realizar ensayos microbiológicos bajo condiciones equivalentes la cantidad de biomasa y su fase de crecimiento debe ser similar. En nuestro caso es importante saber si hay diferencias entre la cantidad de bacterias disponibles en cada tubo independiente de las condiciones de cultivo. Un modo indirecto de cuantificar la biomasa es la absorbancia de luz, que permite evaluar la turbidez del medio. A una mayor concentración celular, el cultivo es más turbio y por tanto se reduce la cantidad de luz transmitida que alcanza la célula fotoeléctrica. Esta reducción de la intensidad de luz transmitida es consecuencia de la difracción por parte de las células (5). La Tabla 2 resume las absorbancias medidas a 570 nm. Se observó que el blanco resultó similar en todos los grupos. En todos los casos la absorbancia medida es mayor que la del blanco, lo cual comprueba efectivamente la existencia de bacterias en los otros.

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TUBO

Grupo 1

Grupo 2

Grupo 3

Grupo 4

1

0,139

0,118

0,171

0,159

2

0,122

0,126

0,158

0,163

3

0,151

0,153

0,202

0,204

4

0,152

0,152

0,213

0,201

5

0,099

0,102

0,149

0,140

6

0,204

0,217

0,253

0,252

7 0,039 0,037 Tabla 2 Absorbancia a 570 nm

0,037

0,038

A fin de evaluar la actividad de β galactosidasa se incubó con ONPG (orto nitrofenilgalactosa) el cual es hidrolizado por la enzima dando como producto ortonitrofenol que produce una coloración amarilla. Sirve como indicador de la reacción pues la intensidad de color se relaciona con la concentración de enzima, para asegurar que esta es una medida de actividad valida se utilizó como control negativo el tubo 7 pues no tiene cultivo, con lo cual se esperaba que la adición de ONPG no produzca cambio de color. Lo anterior efectivamente ocurrió de acuerdo a lo esperado, en la ilustración 2 a la izquierda se observan las muestras (ordenadas del 1 a 7 en sentido de lectura) antes de inocular ONPG y a la derecha el después, donde se observó que los tubos de control no viraron. Por otra parte, la Tabla 3 resume los datos obtenidos al medir la absorbancia a 405 nm en las muestras incubadas con ONPG y a partir de la expresión indicada en la guía se calcularon las unidades de Miller, junto con el desvío y error estándar para cada muestra. Estos resultados se observan en el gráfico 1.

Ilustración 2 A la izq. las muestras antes de ONPG. 5A la der post incubación

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TUBO 1 2 3 4 5 6

1 0,601 0,701 0,581 0,398 0,524 0,642

2 0,555 0,551 0,592 0,406 0,599 0,311

3 0,659 0,573 0,574 0,465 0,414 0,362

4 G4 0,477 0,475 0,499 0,362 0,455 0,444

7 0,078 0,067 0,061 0,056 UM G1

PROMEDIO DESVÍO ERROR

1162,22 1338,82

991,71

773,19

1066,48

209,13

104,57

1668,01 1208,49

940,31

744,89

1140,42

346,22

173,11

998,02 1005,75

690,91

593,04

821,93

183,27

91,64

655,07

510,10

417,18

552,91

95,56

47,78

1651,85 1818,80

629,30

700,40

869,28

1260,08

482,60

241,30

759,60 301,23 309,67 402,91 Tabla 3 Absorbancia medida a 405 nm.

443,35 186,89 93,45 Tabla 4 Unidades de Miller calculadas.

UNIDADES DE MILLER VS CONDICIONES EXPERIMENTALES 2000 1800

Unidades de Miller

1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

0

1

2

3

4

5

6

7

TUBO UM

ERROR +

ERROR -

DISCUSIÓN La regulación del operón lactosa depende del nivel de glucosa en el medio,

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el cual a su vez controla el nivel intracelular de AMP cíclico. Cuando hay glucosa disponible las células crecen a su máximo ritmo porque la pueden usar de modo más eficiente. Si no hay glucosa disponible en la célula, el AMP cíclico se empieza a acumular y se une al sitio alostérico de la Proteína Catabólica Activadora. CAP luego se une al promotor del operón, lo que inicia la transcripción al facilitar la unión de la RNA polimerasa al promotor. De este modo la transcripción del operón lactosa requiere lactosa y ausencia de glucosa. Para evaluar la cantidad de enzima sintetizada se calcularon las unidades de Miller: es una cantidad arbitraria de enzima capaz de hidrolizar 1 nmol de ONPG por minuto a 28 °C y pH 7. En el tubo 1 ante la ausencia de lactosa se esperaba que la síntesis de la βgalactosidasa estuviese inhibida, sin embargo, se observó una de las máximas concentraciones. Entre el tubo 3 y 2 se pudo comparar la mayor eficacia del IPTG como inductor artificial del operón, tomando en cuenta que la concentración de enzima lograda en 2 es mayor que en 3 (donde solo se agregó lactosa). En el Tubo 4 no se agregó SDS y de acuerdo a los esperado la concentración de enzima fue mínima, pues dado que el ONPG no puede atravesar la membrana bacteriana se requiere el lisado de la célula para que la enzima alcance su sustrato. De este modo la reacción solo pudo ocurrir con el contenido de células lisadas por otras causas. En el tubo 5 se esperaba que el agregado de cloranfenicol afectara la concentración de β galactodsidasa, pues es un antibiótico que bloquea la síntesis de proteína inhibiendo la transcripción. Este tubo, sin embargo, presentó la máxima coloración y el mayor número de Miller en promedio (6). En el tubo 6 se agregó glucosa, al haber glucosa esta fue consumida primero y al agotarse se activó el operón lac para poder aprovechar la lactosa. Por este motivo se observó menor concentración de enzima. Tal y como se observó en los resultados la muestra de control sin cultivo no reaccionó ante ONPG con lo cual se observó la ausencia de enzima de acuerdo a 7

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lo esperado. Vistos los resultados del tubo 1 y del tubo con antibiótico no es posible demostrar el control transcripcional para esta actividad enzimática. Adicionalmente el desvío entre los datos recabados es demasiado amplio para tenerlos por confiables sobre todo tomando en cuenta el pequeño número de muestras tomadas. La bibliografía sugiere una hipótesis que incluye dos situaciones que refieren a la represión y a la inducción transcripcional: -

La presencia de lactosa induce la transcripción del operón, pues es capaz de unirse a la proteína represora y generar un cambio conformacional que baja su afinidad por la región operadora. Esto permite a la ARN polimerasa transcribir los genes para sintetizar βgalactosidasa y degradar la lactosa.

-

Por otra parte, la ausencia de lactosa mantiene bloqueado al promotor.

La primera situación pudo comprobarse en los distintos medios, pero el efecto de la ausencia de lactosa no pudo ser demostrada. BIBLIOGRAFÍA 1. Campbell N, Reece J. Biología. 7th ed. Madrid: Editorial Medica Panamericana; 2007. 2. Pierce B. Genética. 5th ed. Madrid [etc.]: Médica Panamericana; 2016. 3. Guía de trabajos prácticos N° 7 IBCM. Departamento de Ciencia y Tecnología. 2019;. 4. Molecular cloning. 3rd ed. Cold Spring Harbor (New York): Cold Spring Harbor laboratory Press; 2001. 5. Almudena León M. Desarrollo de Modelos Cinéticos para Bioprocesos: Aplicación a la Producción de Xantano [Doctorado]. Universidad Complutense de Madrid; 1999. 6. Morales G Y, Herrera M, Muñoz R J. Cloranfenicol, un antibiótico clásico como alternativa en el presente. Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas [Internet]. 2007 [cited 6 December 2019];(Vol 38, número 1):58-69. Available from: https://www.redalyc.org/pdf/579/57938108.pdf 8

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7. Méndez B. Regulación post-transcripcional en el Operon Lactosa de Escherichia Coli K12 [Doctorado]. Universidad de Buenos Aires; 1978.

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