Trafic vésiculaire PDF

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Cours de L2, avec M.LABROUSSE...

Description

LA VOIE DE LA SÉCRÉTION I.

Une expérience historique a permis de mettre en évidence le passage des protéines dy RE dans l’AG

Pulse-Chase cf CM4 Radioactivité  tache noire=argent qui a précipité Fin du pulse léger marquage qui vient des mitochondries. Ag saccule empiler coupe transversale on voit des petits trous. Grâce à la chase on suit la voie de sécrétion les vésicules plus clair sont moins matures. II.

Étude de la sortie des protéines des RE grâce à un outil révolutionnaire : la GFP. Grâce à des mutations des chromophores il a réussi à avoir des fluorescences de plusieurs couleurs

1. Utilisation de protéines chimères fluorescente Sur la protéine on met une ampoule qui s’allume seule. On peut donc suivre en live dans le vivant - Construction d’un vecteur d’expression codant une protéine possédant un Tag fluorescent - Transfection de cellules eucaryotes en culture

2. À la recherche d’une sonde pour l’étude du trafic membranaire. Utilisation d’une protéine virale, glycoprotéine membranaire, que l’on injecte à la cellule (virus à ARN). Une fois l’ARN virale dans le cytoplasme il va être traduit par un ribosome. L’ARN vas se répliquer. La glycoprotéine suit donc la voie de sécrétion donc on va l’utiliser comme sonde. Avant l’injection on va l’étiqueter au GFP, et on la rend thermosensible. Mutant thermosensible : séquence d’ADN muté qui produit toujours la même protéine - T° permissive ou normal o Repliement normal et fonctionnement normale Augmentation de T° non permissive o Repliement anormale et la fonction n’est plus assurer (souvent instable et dégrader)

Étape pour construire la sonde pour suivre le trafic membranaire : VSV-Gts-GFP - ARN viral  ADNc codant la protéine VSV-G - Création d’une forme thermosensible VSV-Gts par mutation de l’ADNc o La protéine est bloquée dans le RE à température restrictive (non permissive) - Insertion de l’ADNc codant VSV-Gts dans un vecteur d’expression eucaryote (cf TD2) - Obtention de l’ADNc de l’étiquette GFP - Insertion de l’ADNc codant GFP dans le vecteur d’expression - Transfection de cellules eucaryotes en culture 3. Résultat : observation de la localisation de VSV-G-GFP Approche expérimentale : - Transfection (plasmide codant pour VSV-Gts-GFP) - Cellules placées pendant 12h à 40°C = T° restrictive - Pendant 15min à 32°C = T° permissive  possibilité de suivre en live

III.

Camillo golgi, découverte d’un organite présent dans toutes les cellules eucaryotes : L’appareil de Golgi

L’appareil de Golgi est proche du noyau mais ne fait pas forcément le tour de celui-ci, c’est un compartiment assez concentré. Le AG est orienté en partant du RE : - Cis golgi o Proche du noyau o Arrivée des protéines o Les vésicules arrivent non recouverte - Médian golgi - Trans golgi - Réseau Trans-golgien o Sorties des protéines o Parte recouverte de clathrine Un sous-compartiment peut-être en plusieurs saccules. Le changement de sous-compartiment se fait par : - Transport vésiculaire - Tapis roulant tout le cis devient médian puis trans etc... Le réseau trans-golgien produit des vésicules mantelé qui partent dans le cytosol. IV.

Les fonctions de l’AG

1. Etiquetage des enzymes lysosomiale Dans le RE les protéines sont N-Glycolysées dans l’AG le motif sucré est modifier. Pour les enzymes qui doivent aller aux lysosomes : une enzyme enlève les glucoses, on module les motifs glucidiques restant ; et une autre ajoute un P en 6 du mannose. C’est l’étiquette Mannose-6P.

2. Maturation des glycoprotéines Modification sur le motif sucré. Différente enzymes : - Retire des mannoses - Ajout de n-acétylglucosamine - Retire des mannoses On simplifie le motif pour le complexifier : ajout de plusieurs sucres (pas toujours le même).

2.1. Outil de l’étude de la maturation des glycoprotéines : l’endoglycosidase-H Elle coupe dans les sucres, protéines de champignons, qu’on utilise comme outils pour connaitre la forme de la protéine. Les protéines en courent de simplification sont sensible à l’endoglycosidase-H. 2.2. Application du test à l’endoglycosidase-H Problématique : la drogue PO isolée de feuille d’eucalyptus empêche le criblage des glycoprotéines à la membrane plasmique de cellules en culture. On prend nos cellules avec une glycoprotéines fluorescence.

Question posée : la drogue PO agit-elle avant ou après l’appareil de Golgi ?

-

Choisir une glycoprotéine transmembranaire et des cellules qui l’expriment Faire un traitement des cellules avec la drogue PO Préparer l’extrait cellulaire et purifier la glycoprotéine (immunoprécipitation) Traiter (ou non) la glycoprotéine purifiée avec l’endoH (in vitro) Étudier l’effet du traitement à l’endoH sur la masse moléculaire apparente de la glycoprotéine purifiée par SDS-PAGE

 Traite à l’endo-H le poids est plus lourds Motif complexe car insensible.  Traite avec PO la protéine est bloqué avec une taille plus basse  Bloqué pendant la maturation  PO + Endo-H : protéine sensible glycolyse type RE  Immature Donc PO agit avant l’appareil de Golgi, il bloque la voie de l’endoH qui agit dans l’appareil de Golgi. 

3. Synthèse des GlycosAminoGlycanes (GAG) et les protéoglycanes Assemble de sucres long et très ramifies. Ils sont rajoutés de manière covalente sur les protéines  protéoglycanes. Ce sont des molécules qui régule les fonctions cellulaires, un certain nombre de molécules de signalisation peuvent être capturé par les protéoglycanes.

4. Les autres fonctions

4.1. Les autres glycosyaltion -

O-glycosylation des protéines (ajout d’un motif sucré sur la serine) que dans l’appareil de Golgi. Glycosylation des lipides  glycolipides

4.2. Clivages protéoliques Enzymes lysosomiale et protéines sécrétées. Pendant la maturation on touche parfois à la séquence protéique. 4.3. Centre de tri -

Plusieurs destinations : exportation de protéines et phospholipides depuis le réseau tran-golgien vers différentes destinations (vésicules). Renvoi de matériel vers le RE

Exemple de vésicule de sécrétion de l’insuline

L’insuline est synthétisée sous forme proinsuline (inactive, beaucoup de repliement) dans le RE, avec des ponts disulfures. Elle part vers le cis-golgi, où des enzymes (3) la clive pour libérer deux morceaux maintenue par des ponts disulfures. Ces modifications ont lieu tout le long du golgi.

Bourgeonnement des vésicules de transport des enzymes lysosomiale V. Une fois dans le réseau trans golgien formation de vésicule grâce à un cargo soluble reconnu par un cargo membranaire (récepteur au mannose 6P). La capture des enzymes lysosomiales est assuré par le M6PR.

1. Deux voies de sécrétion

1.1. La maturation des vésicules de la sécrétion régulée

ines

e puis u

Exemple : vésicule de sécrétion de l’insuline

1.2. La sécrétion régulée un phénomène contrôlé dans le temps et l’espace Question : la sécrétion régulée dans le temps, par un signal (stimulus), est-elle aussi régulée dans l’espace ? Hypothèse : oui. Comment testé cette hypothèse ? Varier les sites de stimulation à la surface de la cellule et compareer avec lessites d’exocytose observés.

SCHÉMA BILAN DES ACTEURS DE LA FORMATION DES VÉSICULES DE TRANSPORT...